偏上皮細胞へのプラスミドのマイクロインジェクションによる低分子量GTPaseの機能を解析する

この手順では、極性化した膜輸送における小GTPaseの影響を解析します。まず、小GTPaseとレポータータンパク質をコードするDNAプラスミドを、極性化した細胞の核に共注入します。次に、レポータータンパク質を小胞体またはTGNに留め、一方で小GTPaseを細胞質に蓄積させる温度でDNAを発現させます。その後、さらなるタンパク質合成を防止するためにシクロヘキシミドを添加し、レポータータンパク質が細胞表面へ輸送される様子を追跡します。

最後に、免疫蛍光分析のために細胞表面のレポータータンパク質を標識します。このアッセイから得られた結果により、共焦点顕微鏡を用いて表面局在の変化を可視化することが可能になります。トランスフェクションのような既存の手法に対する本手法の主な利点は、マイクロインジェクションによって達成される短時間の過剰発現期間中には二次的な影響が最小限に抑えられるため、目的タンパク質の一次的な影響を研究できることです。

この手法は、小型GTPaseがどのように分極化した膜輸送を制御しているかなど、細胞極性分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。マイクロインジェクションを成功させるために必要な個々のステップは、視覚的な補助なしに説明することが困難であるため、この手法の視覚的な実演が極めて重要です。Sigma Aldrich社のエンドトキシンフリー maxi prepキットを用い、製造元のプロトコルに従ってエンドトキシンフリーのプラスミドDNAを単離してください。本実験では、培養に0.4 µmの孔径を持つ透明な12 mmトランスウェルフィルターを3枚使用します。

各フィルターにMDCK細胞を4×10⁵個ずつ播種します。2日後、顕微鏡下で培養状態を確認し、細胞が密な単層に成長していることを検証します。これでマイクロインジェクションに使用可能です。

マイクロインジェクション当日、5 LのMM培地に15 mMのHEISを加えた360 × 15 mmプレートを調製し、39 °Cのインキュベーターに入れる。加えて、1 mLのMEM培地に50 mMのHEISおよび0.1 mg/mLのシクロヘキシミドを加えた12ウェルプレート3枚を調製し、31 °Cのインキュベーターに入れる。マイクロインジェクション用顕微鏡の電源を入れ、加熱ステージ、10倍および32倍の対物レンズ、そしてEinor FemtoJetを備えた倒立顕微鏡をセットアップする。

加熱ステージを39 °Cに設定します。また、エアテーブルへの窒素ガスボンベの供給バルブを開きます。次に、DNAをろ過水で希釈し、最終濃度を0.2 mg/mLにします。

続いて、DNAをマイクロ遠心機を用いて13,000 RPMで30分間遠心分離します。上層部を取り除き、新しいチューブに移します。次に、手術用メスで培養皿から最初のフィルターを取り出し、フィルターホルダーからフィルターを切り出して、39 °Cに加温した5 mLのMEM増殖培地と50 mMのHEPESを含む調製済み60 × 15 mmプレートに配置して、MDCK細胞を準備します。

培養プレート内のフィルターを固定するため、フィルターの中央に外科用メスを置き、次に培養プレートを顕微鏡の加熱ステージ上に移動させます。希釈したDNAを2〜3 µL、マイクロインジェクション用ニードルに充填します。ニードルの保護カバーを回して外し、取り除きます。

ホルダーにニードルを装着するには、インジェクターのメニューキーを押し、バルブが閉じていることを確認します。ニードルをホルダーにねじ込みます。この際、ニードルを締めすぎないように注意してください。

破損につながる可能性があるため、再度メニューキーを押してください。これにより、設定した補正圧が作用し、マイクロインジェクションの手順中に培地が針内に吸引されるのを防ぎます。最後に、ジョイスティックを軽く操作して保存されたホーミング情報を消去し、針を細胞まで下げてください。

10倍対物レンズを使用し、液面上の光路内に針を導入します。次に、細胞に焦点を合わせます。フォーカスホイールを180度上に回して再度焦点を上げ、針を確認します。

ゆっくりと針に焦点を合わせます。その後、再び焦点を外します。そして、再び細胞に焦点を合わせるように調整します。

再び針にピントを合わせます。針が培地表面に接触し、ハロー（光輪）が観察されるまでこの操作を繰り返します。さらに、細胞にピントが合う一方で、針は焦点面外にありぼやけて見える状態になるまで調整を続けます。

次に32倍の対物レンズに切り替え、粗動でピントを合わせます。針先で頂端膜に接触させ、そこから約10 µm差し引いた位置にZ制限を設定してください。核は頂端膜から約10 µm下に位置しているためです。

次に、針を焦点面から数ミクロン外へ、できるだけ速く移動させます。針を核の上に合わせ、ジョイスティックの注入ボタンを押し、離します。適切な注入圧を見つけるため、まずは 95 PSI で開始してください。

圧力が強すぎると、細胞は破裂します。圧力が弱すぎると、白い点だけが残り、それ以外の変化は起こりません。細胞の大きさを変化させずに、相転移を伴う注入を成功させてください。

細胞の上に置いた手術用メスの穴の中に、100〜500個の細胞を注入します。次に、細胞を培養皿および手術用メスとともに39 °Cのインキュベーターに入れ、2時間インキュベートします。最後に、細胞を、1 mLのMEMに50 mMおよび0.1 mg/mLのcyclo heximideを添加して準備した12ウェルプレートに移し、31 °Cで2時間インキュベートします。

発現したGFPシグナルの退色を防ぐため、以降の表面染色のすべての工程において、アルミホイルで遮光して検体を保護してください。細胞を入れた培養皿を氷上のメタルプレートに置き、氷冷PBS++で1回洗浄します。氷上のメタルプレートにきれいなパラフィンフィルムを敷き、標的タンパク質のエクトドメインを認識する抗体を30 µLずつ滴下します。

次に、細胞を含むフィルターを液滴の上に裏返して置き、フィルターの裏側に抗体を数滴加えます。氷上で1時間インキュベートします。氷冷したPBS++で細胞を3回洗浄し、3%パラホルムアルデヒドを用いて室温で15分間固定します。

細胞をPBS++で1回洗浄し、PBS++中で5分間平衡化します。次に、細胞をブロッキング透過バッファー（blocking permeable buffer）でインキュベートします。室温で1時間インキュベートし、発現しているRAB GTP ACEを検出するために、一次抗体をBPBで1:200に希釈します。13,000 RPMで10分間遠心分離し、抗体溶液30 µLをウェットチャンバーに配置した清潔なパラフィルム上にピペットで滴下します。

フィルター上の細胞を抗体液に滴下した面を下にして置き、1時間インキュベートします。室温で細胞を12ウェルプレートに戻し、適切な二次抗体でインキュベートした後、洗浄工程を含め、室温でBPBを用いて30分間にわたり5回洗浄します。

フィルター上の細胞を脱イオン水に3回浸し、10 µLのマウント液を滴下したマイクロスライドガラスの上に正立させて配置します。18 × 18 mmのマイクロカバーガラスを上に載せ、フェイシャルティッシュを用いてカバーガラスを細胞に向かって静かに押さえます。最後に、爪用ポリッシュで密封します。VSV-G-TS045-GFPをコードするプラスミドのみを注入した擬似注入（mock injection）において、タンパク質は、十分に分極していない細胞における赤色の表面染色の結果に基づき、十分に分極したMDCK細胞の基底外側面に送達されます。

GFP融合タンパク質の一部が頂端膜に輸送されることがあります。対照試料がこのような状態である場合、データは信頼できず、より極性化した細胞を用いて実験をやり直す必要があります。全タンパク質における広範な細胞内グリーンシグナルが示す通り、31°Cでのチェイスの間、発現したすべてのGFP融合タンパク質が基底側膜に輸送されるわけではないことに注意してください。この手法を習得すれば、開発後の所要時間は約10〜12時間となるはずです。

この手法は、膜トラフィッキング分野の研究者が極性上皮細胞における調節タンパク質を探索するための道を切り開きました。このビデオを視聴することで、マイクロインジェクション法を用いて極性上皮細胞にタンパク質を発現させる方法について十分に理解できるはずです。