開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

上皮組織の維持には、バリア機能を損なうことなく、損傷した細胞や死滅しつつある細胞を継続的に除去する必要があります。これを達成するため、上皮組織は死細胞の周囲にある細胞にアクチンとミオシンのリングを形成・収縮させ、死細胞を排出すると同時に、その退出によって生じ得る隙間を塞ぐことで、死細胞を押し出します。このビデオ記事では、ゼブラフィッシュ幼魚の表皮からアポトーシス細胞が押し出される様子をリアルタイムで誘導し、可視化する方法を紹介します。

ここでは、表皮に緑色蛍光タンパク質を発現する形質転換ゼブラフィッシュ胚の1細胞期に、赤色蛍光タンパク質で標識したF-アクチンプローブを注入することで、上皮組織におけるアクチンフィラメントを可視化しています。GFPとRFPの両方を発現する受精後4日目の稚魚にG418を投与し、表皮にアポトーシスを誘導します。脱出過程で起こるアクチンダイナミクスと上皮細胞の形態変化を、回転円盤共焦点顕微鏡を用いたタイムラプスイメージングにより可視化します。

免疫力分析などの既存の手法と比較して本手法の主な利点は、生きた上皮組織における細胞排除プロセス中に起こる急速な変化やアクチンダイナミクスを観察できる点にあります。このビデオでは、発生中のゼブラフィッシュの表皮からアポトーシス細胞が排除される様子をリアルタイムでイメージングする手順を解説します。当研究室ではこの手順を用いて、バリア機能を維持しながらアポトーシス細胞を除去するために、細胞がどのように協調してアクチン細胞骨格を再構成しているか、また排除プロセスの崩壊がどのように特定の疾患状態につながるかを研究しています。

それでは、開始しましょう。発生中のゼブラフィッシュの表皮における細胞押し出し時のアクチンダイナミクスを可視化するために、まず、 previously transcribed RNAを氷上で解凍します。私たちは、utrophinのcalponin相同ドメインおよびアクチン結合タンパク質に融合させた赤色蛍光タンパク質をコードするMr.mRNAを転写します。RNAにフェノールレッドを1:1の比率で加え、最終的なRNA濃度を約30 ng/µLにし、バックフィリング法により1 µLの溶液をプルドキャピラリーニードルに充填します。

E3バッファー中で、1細胞期のC-K-G-F-P胚を約75個回収します。回収した胚を5¾径のパステールピペットでマイクロインジェクション用モールドに分注し、Dumont 5番ピンセットを用いて溝の中で胚を慎重に方向付けます。標準的な研究室用解剖ステレオ顕微鏡下で作業を行い、異なるステージの胚にRNAを注入することにならないよう、迅速に作業してください。

圧力制御マイクロインジェクターを用いて、フェノールとして胚の卵黄にRNAを注入します。注入後、胚に赤色が見えることを確認してください。各実験につき、少なくとも50個の胚に注入してください。

胚を分級して、未受精卵や損傷した卵を除去し、残りのすべての胚を28 degrees Celsiusでインキュベートします。24時間後、蛍光解剖顕微鏡を用いて、表皮に高いレベルのGFP蛍光があり、RFP標識の活性蛍光を持つゼブラフィッシュ胚を選別します。選別した胚を28 degrees Celsiusでインキュベートし、アミノグリコシドへの曝露によるアポトーシス誘導の薬剤処理準備が整うまで保持します。

抗生物質 G 418 または薬剤は、発生過程にあるゼブラフィッシュ稚魚の表皮からアポトーシス細胞の脱出を引き起こします。重要な点として、この処理による細胞脱出の誘導は、受精後 4 日目以降の稚魚でしか機能しません。GFP と RFP の両方を発現している受精後 4 日目のゼブラフィッシュ稚魚を最大 25 匹回収し、3 mL の E 3 培地を含む 35 × 10 mm の培養皿に入れます。

培地を、1 mg/mLのG four 18を含むE three 3 mLに慎重に交換し、28 °Cの暗所で4時間、薬剤に浸漬させて幼虫をインキュベートします。その後、培地を除去し、0.02% tricaを含む予熱したE three培地に交換して、イメージング用の幼虫のマウント工程に進みます。最大3匹までの幼虫を1.5 mL Fendorチューブに移し、E three培地の大部分を除去します。

先端を切断したピペットチップを用い、1% low melt agaroseを120 µLチューブに分注して混合します。次に、幼虫とagaroseの混合液を、Matech培養皿の底にあるカバーガラス上に静かにピペッティングします。インサートピンまたはタングステン針を装着したFSTピンホルダーを用い、幼虫がカバーガラスに対して直線的に平らになるよう速やかに向きを調整します。

アガロースを凝固させます。その後、0.02% tricaを含むE3中 Mediumをディッシュに静かに満たします。発生中のゼブラフィッシュ幼魚の表皮からのアポトーシス細胞の押し出しの全工程には、約20分かかることが判明しています。

ここでは、回転ディスク共焦点顕微鏡とand or IQソフトウェアを用いて、ゼブラフィッシュ表皮の単層における一連のZ平面を収集するためのタイムラプスイメージング実験のセットアップ方法を説明します。まず、and or IQソフトウェア内で、アルゴンレーザー、ヘリウムネオンレーザー、顕微鏡カメラ、およびエピ蛍光ランプの電源を入れます。次に、イメージングを行う波長を含むタイムシリーズプロトコルを作成します。

画像のキャプチャ間隔の頻度と、キャプチャを繰り返す回数を設定します。検体を入れたMattecディッシュを顕微鏡ステージにそっと置き、透過光を用いて20倍対物レンズで幼虫に焦点を合わせます。次に、40倍の水浸対物レンズを正しい位置に移動させます。この対物レンズを使用することで、1視野あたり約20〜25個の細胞を撮影でき、細胞内アクチンダイナミクスを解像しながら、押し出し（extrusion）中の細胞挙動を追跡することが可能です。

40倍対物レンズの先端に水を1滴慎重に滴下し、その上にMattecディッシュを素早く載せます。明視野照明を用いて検体を特定し、次に488 nmのエピ蛍光を用いて、GFP陽性の表皮に特異的に焦点を合わせます。共焦点スキャンモードに切り替えます。

各チャンネルのレーザー強度と露光時間を適切に調整します。信号を最適に検出できるよう、また光毒性を防ぐために、レーザー出力と露光時間のバランスに注意してください。突出細胞を特定するには、エピ蛍光顕微鏡を用いてGFPで標識された表皮を可視化し、中央の小さな円形の細胞を囲む細胞群からなる、典型的なロゼットパターンの細胞群を特定します。

さらに、細胞の脱落（cell extrusion）の特徴である、中央の小さな円形の細胞の周囲にリング状に蓄積したRFP標識アクチンが観察されるはずです。脱落している細胞を特定したら、速やかにZシリーズの上限・下限およびステップサイズを設定してください。その後、4つのD共焦点データセットの取得を開始し、データを参照して、アクチンリングの収縮および死細胞の周囲で起こる上皮細胞の挙動を可視化します。

経時的にZシリーズの3D投影図を作成し、データを動画ファイルとして保存します。この工程は、さまざまなソフトウェアパッケージを用いて実行可能です。この図は、受精後4日目のCK GFPゼブラフィッシュ幼魚の表皮におけるRFP UTR CHの発現を示しています。

ここでは、ライブアクションのダイナミクスを追ったタイムラプス動画のZ投影静止画を示します。上皮細胞の脱出（エクストルージョン）の過程において、矢印は隣接する細胞によって形成されたアクチン環を示しており、これが2分間で収縮し、閉鎖します。この手順に続き、化学的阻害剤の使用や遺伝子変異などの他の手法を本技術と組み合わせて用いることで、脱出の変化がどのように特定の疾患状態につながるかをより深く理解することができます。

アポトーシス細胞の除去不全に基づき、発生中のゼブラフィッシュの表皮から細胞が押し出されるプロセスを可視化するためのタイムラプスイメージング実験のセットアップ方法について説明しました。この手順を実施する際は、フォトブリーチング（光退色）や光毒性を防ぐため、標本に照射する光量を制限することが重要です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。