低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

エイズの原因となるウイルスであるHIVに、6,000万人以上の人々が感染しています。HIV/エイズは世界的な保健危機であり、集中的な研究努力によって感染者の生存期間は劇的に延びましたが、真のワクチンは依然として実現していません。HIVワクチン研究の主要な焦点は、HIVが標的細胞に進入するために利用するエンベロープ糖タンパク質です。

このビデオでは、クライオ電子トモグラフィーというイメージング技術を用いて、この重要なタンパク質の構造をどのように取得するかを実演します。精製したHIVから始まり、凍結試料の調製手順、これらの凍結試料からの電子顕微鏡画像の記録手順、およびこれらの画像をHIV/AIDSワクチンの設計に有用な構造モデルに変換する手順を示します。このビデオで提示する内容のユニークな点は、中学生や高校生から、大学生、大学院生、さらには博士研究員やシニアサイエンティストまで、幅広い年齢層の彼女の研究室のメンバーがこの作業を実演することです。

クライオ電子トモグラフィーに適したガラス化ウイルス試料の作製は、銅グリッドで支持されたカーボンフィルム上の小さな穴にウイルスの水性懸濁液を広げ、その後ウイルスを急速凍結させることで行われます。この工程の目的は、ほぼ天然に近い状態で保持された無傷のウイルスの凍結試料を作製することです。まず、グリッドをグロー放電装置の中に設置します。

この装置は、グリッドをイオン化ガスにさらすことで洗浄します。グリッドの使用準備が整ったので、小さな金粒子を混合したウイルス懸濁液を調製します。これらの粒子は、データ収集および処理において不可欠です。

次に、ウイルス懸濁液を1滴、プラズマ洗浄したばかりのグリッド上に滴下します。その後、グリッドをロボットに装填し、フィルターペーパーでブロッティングを行うことで、液滴を薄い液膜まで減少させます。次に、サンプルを液体エタンにプランジさせ、1秒間に100,000ケルビンを超える速度でウイルスを急速凍結させます。

その後、プランジ凍結したグリッドを顕微鏡まで輸送するための保存ボックスに移します。目的の数のグリッドが凍結されるまで、この操作を繰り返します。ウイルスサンプルのグリッドの準備が整ったので、次のステップでは、これらを顕微鏡にロードします。

イメージングは、手動またはロボット支援によって行うことができます。サンプルグリッドを手動でロードする場合、ユーザーは液体窒素下でサンプルを操作できる専用のステーションに座り、サンプルを携帯用の窒素冷却チャンバーに配置します。その後、チャンバーを密閉して真空にし、顕微鏡に取り付けます。新しい顕微鏡では、より自動化されたサンプルロードが可能です。

Titan Cryos顕微鏡では、ユーザーによって凍結試料が搬送され、その後、顕微鏡内にセットされた試料グリッドとともにロボットによってロードされます。撮影を開始する前に、ユーザーは各グリッドを確認することができます。顕微鏡のパラメータは、試料グリッド上の関心領域ごとに設定されます。

このケースでは、特徴量としてHIVウイルスを用います。新しい領域が定義されるたびに、顕微鏡のコンピューターにその領域固有のイメージングパラメータが保存されます。ユーザーが関心のあるすべての位置を定義すると、コンピューターが各位置を自動的に再訪し、データセットを収集します。

各データセットは、電子ビームがグリッド上の同一箇所に焦点を合わせ続けた状態で、試料グリッドを電子ビームに対して傾斜させることで収集されます。電子顕微鏡におけるデータ収集は、従来、ユーザーが顕微鏡の前に座り、装置を物理的に操作することを必要としていました。このような顕微鏡の操作形式が、オバマ大統領のインテル工場訪問時の映像に示されています。

顕微鏡のコンピュータインターフェースの最近の進歩により、研究室内のリモートコンピュータやその他の場所から、データの収集状況をリアルタイムで監視し、調整することが可能になりました。エンベロープや糖タンパク質のスパイクの形状を可視化するには、数百枚の個別の画像からの情報を平均化して信号を増幅させる必要があります。これは計算負荷の高いプロセスであり、本手法ではBio Wolfと呼ばれるコンピュータクラスターを用いて行われます。

NIH（アメリカ国立衛生研究所）において、個別のボリュームを抽出し、高いノイズレベルでも動作可能なアルゴリズムを用いて情報を平均化する強力な手法が開発されました。この種のデータに固有の特性として、天然のウイルスおよび生物学的に重要な分子と複合体を形成したウイルスの両方から得られた密度マップは、HIVの構造生物学に関する豊富な情報データベースを提供します。これらの密度マップは、エンベロープ糖タンパク質スパイクを構成する個々のサブユニットのX線結晶構造解析による情報と組み合わせることで、分子レベルの詳細な構造として具体化されます。

これらのトモグラフィーから得られるデータは非常に高密度であり、解析が困難な場合があります。エンターテインメント業界向けの3Dソフトウェアを使用して、3Dモデルに色、テクスチャ、ライティングを加えることで可視化し、解析を容易にすることができます。一般的に使用される可視化ソフトウェアには、Mirror 3D Studio MaxやMayaなどがあります。

精製されたHIVを用いた、エンベロープ糖タンパク質の構造に関する分子モデルの取得手順をステップバイステップで実演しました。この手法を用いて、ウイルスに結合し利用可能なさまざまな分子とエンベロープ糖タンパク質との複合体構造も決定しています。

ここでは、B12と呼ばれる抗体と複合体を形成したエンベロープ糖タンパク質の構造例を示します。なぜ一部の分子はウイルスに結合し利用できる一方で、他の分子はそうではないのかを理解することは、合理的なワクチン設計において非常に重要です。HIVや、インフルエンザ、エボラなどの他のウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質の分子構造を決定することは、ウイルスの侵入と利用を理解するための鍵となります。

これまで見てきたように、クライオ電子トモグラフィーはこの目的を達成するための強力なツールとして台頭しています。