クライオ電子顕微鏡によるHIV - 1キャプシドアセンブリの構造とヘリカル実空間の反復再構成

この手順の全体的な目的は、クライオ電子顕微鏡を用いて、ヘリカルに組み立てられた分子の三次元構造を得るための手法を提供することです。プロトコルは、凍結水和EMグリッドを調製する際に、急速希釈およびバックサイドブロッティング法を用いて塩濃度を一時的に低下させるクライオEM試料調製から始まります。このプロセスにより、タンパク質の安定性を確保しつつ、バックグラウンドノイズを低減させ、その後のデータ収集におけるクライオEM低線量データ収集の信号対雑音比を向上させることができます。

回折パターンのヘリカルインデックス付けが完了します。その後、画像処理を行い、続いて実空間での3D再構成を行うことで、最終的なHIVカプシドまたはcaチューブの密度マップが得られます。一般的に、この手法に不慣れな方は、最適なデータ収集と解析のためにいくつかの重要な注意点があるため、習得に苦労することがあります。

例えばHIVの場合、1モルのソース溶液中でしか形成されないカプシド管状アセンブリがあり、構造に影響を与えることなく塩濃度を急速に低下させることができます。高品質なcryo EM画像を得ることは極めて重要です。チューブの画像が与えられたとき、重要なチューブをインデックス化するために何をすべきか、また3D再構成を行うためにどのソフトウェアを検討すべきかを習得することは非常に困難です。

このビデオでは、物理的オブジェクトの3D再構成を得るための詳細かつ簡潔なアプローチを解説しており、実験の参考として活用いただけます。Puja博士と共に手順を実演します。私たちは二人ともDr.Laboratoryのポストドクターです。cryo-EM用のHIV-1カプシドタンパク質複合体を調製するために、まず200メッシュの銅グリッドのカーボン側を25 mAで25秒間グロー放電させます。

ネブライザーを使用して、自作の手動重力プランジャーである環境チャンバー内の湿度を80%に調整します。その間、液体窒素を用いてvitroボトルのプランジャードゥー内の液体エタンを冷却し、プランジ凍結ドゥーを手動重力プランジャーに取り付けます。次に、ピンセットを使用してグリッドの端を挟んで固定します。

あらかじめ調製したタンパク質溶液2.5 µLをグリッドのカーボン側に滴下します。次に、グリッドのカーボン側を外側に向けて、プランジャーにピンセットをセットします。グリッドの裏側に低塩濃度希釈バッファーを3 µL加えます。

直ちにフィルターペーパーでグリッドの同じ面を吸い取ります。グリッドの背面全体をフィルターペーパーに密着させたまま、約6秒間保持してください。フィルターペーパーを取り除いた後、すぐにグリッドを液体エタンにプランジします。

最後に、プランジャーからピンセットを取り外し、速やかにグリッドをグリッド保存ボックスに移します。凍結水和グリッドをFEI polar G two電子顕微鏡にロードし、クライオ電子顕微鏡観察を開始します。加速電圧200 kilovoltsで動作し、Gatan 4K by 4K CCDカメラを搭載した装置を使用します。

低線量サーチモードで、倍率を約 200 x に設定します。グリッド全体を走査し、適切な氷がある領域を確認します。これらの領域の位置をステージファイルに保存します。

保存した位置を呼び出し、これらの領域をさらにスクリーニングします。低線量サーチモードで、3,900 xの倍率を追加してください。ホールの上に長いチューブが懸垂していることを特徴とする、データ収集に適した均一な薄い氷の層がある領域を選択します。

すべての領域を第2ステージファイルに保存します。露光モードに切り替えます。倍率を 59,000 x に設定し、100 micrometer の対物絞りを挿入します。

次に、1回の露光あたり約15 electrons/Ųの線量になるよう、対物レンズのスティグマータとビーム強度を調整します。低線量探索モードに戻り、保存した位置へ移動します。適切なチューブを同定し、中心に合わせます。

CCDカメラを使用してフォーカスモードに切り替え、ピントを調整し、通常0.5から2.5 µmのデフォーカス値を設定します。次に、露光モードに切り替え、線量15 electrons/Ųとなるよう露光時間を0.3から0.5秒に設定します。プレートカメラで画像を収集し、露光を開始する前にフィルムを10秒間静置させてください。

画像の収集後、次の保存位置に移動し、このプロセスを繰り返してさらに画像を収集します。フィルムを原液のD 19で12分間現像します。その後、Nikon Super cool scan 9, 000 EDスキャナーを用い、ピクセルサイズ6.35 micrometersで画像をデジタル化します。

らせん状の物体は、2つのパラメータによって指標化できます。それは、らせん状物体の表面格子のフーリエ変換におけるベッセル次数Nとレイヤーライン番号Lです。各レイヤーラインはNとLによって特徴付けられ、HおよびK指数で表される表面格子上の線群に対応しています。

ヘリカルインデックス付けを開始するには、ImanのプログラムHelix boxerを使用して、直径が均一で比較的長くまっすぐなチューブをボックスアウトし、画像をMRC形式で保存します。次に、Imanのプログラムboxerを使用してチューブの半径を測定します。MRCパッケージに含まれるI-M-G-C-C-Fなどの相互相関ベースのプログラムを使用して、HELリピート距離を決定します。

次に、フォワイエ計算を行います。繰り返し距離の整数倍となる新しいボックス長を用いて変換します。次に、FFTピクセル単位で(1, 0)および(0, 1)の2つの基本表面格子ベクトルを定義する、2本の主層線を選択します。

フーリエ変換における2本の主要なレイヤーラインのレイヤーライン番号および最大振幅半径を決定します。2本の主要なレイヤーラインのレイヤーライン番号とベッセル関数の次数がわかれば、記載の手順に詳述されている選択則を用いて、サブユニット間の回転角と1本鎖ヘリックスの軸方向の進み（axial rise）を求めることができます。これら2つの実数は、チューブのらせん対称性を記述するものです。

3D再構成は、ImanプログラムのBoxerを用いた粒子のセグメンテーションから始まります。helices粒子を含む電子顕微鏡写真を開いた後、Boxerのコントロールパネルで粒子をオーバーラップするセグメントに切り出します。helixモードを選択し、ボクシングのパラメータを設定してください。

ボックスのサイズは粒子の直径よりも大きく、OLAの値はボックスサイズの約90%にする必要があります。左側を決定した後、粒子ボックスの両端のいずれかをクリックすると、ヘリックスの長さに沿って一連の粒子ボックスが自動的に生成され、ボックス化されたセグメントとその座標が保存されます。次のステップは、I-H-R-S-Rによる処理を行う前に、反復的ヘリカル実空間再構成法（I-H-R-S-R）を用いて初期3D再構成を行うことです。

クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）画像のコントラストを反転させ、ローパスフィルタ（LOWPASS filtering）を適用します。次に、generatorと入力してI-H-R-S-Rプログラムのグラフィカルインターフェースを開きます。スタックの名前とパス、スタック内の画像数、および対称性パラメータの値を含む、ボックス処理済み粒子スタックに関するすべての情報をグラフィカルインターフェースに入力してください。

完了ボタンをクリックして再構成スクリプトを作成します。B 25 SP.Iでは、初期参照として中実または中空のシリンダーを使用し、定義されたらせん対称性に変化がなくなるまで手順をサイクルさせます。通常、これは数サイクル後に発生します。右ねじ対称性を用いれば、安定的に収束した再構成が得られるはずです。

前サイクルで生成された再構成結果を、さらなる精緻化のための初期リファレンスとして使用します。最後に、I-H-R-S-Rによって生成された3D密度マップを、精緻化工程における追加リファレンスとして用いて、反復的精緻化を伴う3D再構成を行います。らせん対称性は、I-H-R-S-Rの手順で決定されたサブユニット間の回転および軸方向の立ち上がり（axial rise）で固定します。

次に、CTF find、CTF tiltなどのSpiderプログラムを用いて、マイクログラフに存在するデフォーカスと非点収差を決定し、FTおよびmuを用いて粒子セグメントにコントラスト伝達関数（CTF）を乗じます。マルチリファレンスアライメントを用いて、参照ボリュームの投影図とCTF補正済み画像を比較し、投影マッチングを行います。面外傾斜角の変動範囲は±10度に制限し、1度刻みでサンプリングします。また、0度または180度付近の面内角度における高い相関係数や、X方向のシフト量への制限などの制約を導入します。

各セグメントのアライメントパラメータについて、制約を満たすセグメントのみを再構成に含めます。各反復精緻化サイクル後、逆投影を用いて3D再構成を生成し、CTFの2乗で除算して、らせん対称性を適用して対称平均化ボリュームを生成します。新しい3D再構成の分解能にそれ以上の改善が見られなくなった時点で、反復精緻化を終了します。

単一のHIV-1カプシドアセンブリである92eチューブをボックスアウトし、ヘリックスインデックス作成のためにフーリエ変換を計算した。2つの半径、層線番号、および層線10および01の最大振幅半径を決定した。その後、繰り返し距離5195.48 angstromsに対し、10および01についてそれぞれ-12および11の端値を算出した。このチューブの螺旋対称性は、delta Z = 6.81 angstromsおよびdelta five = 328.88 degreesと決定された。I-H-R-S-Rを用いてdelta Zとdelta fiveを7.13 angstromsおよび328.86 degreesに精緻化し、10回の反復サイクルの後に初期再構成を生成した。

反復的な精緻化後の最終的な再構成により、I-H-R-S-Rを用いて算出された初期モデルから密度マップが大幅に改善されました。カプシド集合管の密度マップは、管軸に平行で表面に近い3つの直交スライス、管軸に垂直なスライス、および管軸に平行で管軸を通るスライスとして表示されています。表示されている構造は、100%の体積を囲む1.8 Sigmaで等高線処理された3D密度マップのサーフェスレンダリングによるものです。

このビデオを視聴することで、クライオ電子顕微鏡を用いてアセンブリされた分子の3D構造を得る方法について、十分な理解を深めることができます。