磁気共鳴イメージングのための準備、精製、および造影剤として使用するための希土類錯体のキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目的は、生体高分子のタグ付けに使用可能なランタノイド含有錯体を合成、精製し、特性解析することです。これは、まず溶液のpHを制御しながら、金属出発物質と配位子を混合することで達成されます。手順の第2ステップでは、得られた錯体を透析を用いて精製します。

次に、遊離金属が存在しないことを確認する必要があります。本手順の最終ステップは、イメージングに関連する複合体の特性評価です。最終的に、緩和能測定を通じて、合成した複合体が造影剤として機能することを示す結果を得ることができます。

この手法は、造影剤がタンパク質に結合した際に水の配位数に変化が生じるかなど、イメージング分野における重要な疑問への回答に役立ちます。一般的に、この手法を必要とする方は、pHを厳密に制御しすぎるとLIが生物教育に不適切な状態になるため、苦労することになります。透析と活性測定の実演は、BudaおよびSashiが行います。

私の研究室の大学院生による手順です。ランタノイド塩を用いたメタレーションを開始するには、まず1当量の配位子を水に溶解し、30から265 millimolarの溶液を作成します。ここでは、配位子Paraiso Benzyl DTPAを73 Millimolarの濃度で使用しています。次に、1 molarの水酸化アンモニウムを添加し、配位子溶液のpHを5.5から7の間に調整します。

このビデオでは、1 Mの水酸化アンモニウム溶液0.2 mLを使用して、1〜2当量のランタノイド塩化物を水に溶解し、5〜1000 mMの濃度の溶液を調製します。塩化ユロピウムまたは塩化ガドリニウムを111 mMの濃度で使用することが可能です。多くの場合、反応を完結させ、その結果として精製を簡略化するために、過剰量の金属が使用されます。

次に、攪拌しながら、調製したリガンド溶液に各ランタン塩溶液を加えます。続いて、0.2 molar 水酸化アンモニウムを加えて、得られた反応混合物の pH を 5.5 から 7 の間に調整します。ここでは、溶液の調整に合計 0.5 milliliters の 0.2 molar 水酸化アンモニウム溶液を使用します。

使用するリガンドに酸に敏感な官能基が含まれている場合は、このステップの間に数回pH調整を行ってください。溶液が塩基性に傾きすぎると、イソチオシアネートなどの塩基に敏感な官能基が使用不能になるため、pH調整の際は十分にご注意ください。コンジュゲーションにおいては、pH測定によって反応を注意深くモニタリングしてください。

pHが一定に保たれた時点で反応は完了となります。塩基に敏感な官能基を持たないリガンドの場合、pHを上昇させる後処理が有用な場合もあります。透析による後処理を開始するには、サンプル量に加え、さらにサンプル量の10%を保持できる余裕を持たせた適切な長さの透析チューブを決定します。その後、製造元のガイドラインに従って、チューブをこの長さに切断します。

このビデオでは分画分子量100～500 Daltonのメンブレンを使用しましたが、必要に応じてより大きな分画分子量のチューブを使用することも可能です。接合をメチル化の前に行う場合は、メーカーのガイドラインに従い、切断した透析チューブを室温で15分間水に浸してください。次に、透析液として使用する水で透析リザーバーを満たします。ここでは1Lのビーカーを使用しています。

透析液の量は、サンプルの約100倍にする必要があります。次に、チューブの端を2回折り返し、折り返した部分を透析用クローズクランプで固定します。透析中に確実に閉じたままであるよう、クランプした端をゴムバンドで巻いて固定してください。

あらかじめ準備した反応混合物を0.2 micronフィルターでろ過します。次に、ろ液をチューブの開放端にロードします。その際、チューブを破かないように注意してください。

チューブを閉じるために十分なヘッドスペースを残すようにしてください。チューブの残りの開口部を2回折り返し、クロージャーで固定し、そのクロージャーを輪ゴムで巻いて固定します。次に、空気が入ったガラスバイアルを、別の輪ゴムを使用して透析チューブの一端にあるクランプに取り付けます。

次に、砂を入れたバイアルをもう一方のクランプに取り付けます。これらのバイアルを使用することで、チューブが透析液に浸かったままの状態になります。これで、チューブ全体を透析液が入った透析リザーバーの中に配置します。

マグネチックスターラーを用い、室温で低速で透析液を撹拌します。撹拌速度は低速に保ち、溶液がボルテックスされないように注意してください。1日の間に3回、透析液を交換します。

このビデオでは、2.5時間、6.5時間、および11.5時間後に透析液を交換します。その後、合計20時間から28時間になるまで一晩透析を継続させます。透析が完了したら、チューブを透析液から取り出し、一方の封止部を慎重に開けてサンプルを取り出します。

透析チューブを水で3回洗浄し、洗浄液をサンプルに合わせます。最後に、減圧下でサンプルから水を除去します。これは凍結乾燥によって行われます。

試料を凍結させ、凍結乾燥装置に設置します。試料中の遊離金属の存在を評価するため、まず、1.4 mLの酢酸を400 mLの水に溶解して酢酸緩衝液を調製し、1 Mの水酸化アンモニウムでpHを5.8に調整した後、水を加えて全量を500 mLにします。次に、各錯体0.3 mgを0.3 mLの緩衝液に溶解します。

次に、pH 5.8の緩衝液中で16 µMとなるxolオレンジ指示薬を調製します。あらかじめ溶解させた金属錯体に、この指示薬溶液を3 mL加えます。指示薬の色が黄色から紫色に変化するのを観察することで、遊離金属の存在を検出します。

必要に応じて、検量線を作成することで遊離金属量を定量できます。遊離金属が残っている場合は、特性評価の前に、透析または高速液体クロマトグラフィーを用いてサンプルをさらに精製してください。次に、アヘンサンプルの水配位数 Determining を決定するために、水中で約 1 mM のアヘン含有錯体溶液を調製し、さらに重水中で同濃度の溶液を調製します。

分析の前に、重水溶液を3回蒸発および重水への溶解に供して残留水を除去し、分光蛍光光度計の電源を入れ、水溶液を清潔なキュベットに加えてキュベットを分光蛍光光度計にセットします。次に、励起および蛍光測定を行い、それぞれの極大波長が約395 nmおよび595 nmであることを確認します。その後、先ほど決定した励起・蛍光波長と、ここに表示されているパラメータを用いて、リン光時間減衰実験を行います。

得られたルミネッセンス減衰データを用いて、調製した重水溶液でこの手順を繰り返します。強度の自然対数を時間に対してプロットしてください。これらの直線の傾きが減衰速度となります。本ビデオでは、rawデータから自然対数プロットを作成するためにMicrosoft Excel 2007を使用しました。

ここで示されているHorsらによって開発された式の崩壊率を使用してください。リガンドに金属に配位したOH基またはNH基が含まれている場合は、使用前に式を修正する必要があります。まず、サンプルの相対的な測定値を決定するために、緩和時間分析装置でT1またはT2のいずれか希望するアプリケーションモードを選択してください。

ここでは、T1設定を選択します。次に、水系溶媒中に異なる濃度のランタノイド含有錯体を含む一連の試料を調製します。ここでは溶媒として水を使用し、10、5、2、0.5、1.25、0.625、および0の溶液を調製します。

ミリモル濃度で調製します。他の適切な溶媒や緩衝液を使用することも可能ですが、その際は当該の溶媒をブランクとして使用することが重要です。サンプルの最終容量は、使用する装置によって異なります。

装置にサンプルをセットし、装置の温度（本ビデオで使用したユニットでは37 °C）に平衡化させるため、5分間放置します。次に、ソフトウェアのパラメータを調整してT1またはT2の滑らかな指数曲線を得ることで、緩和時間を秒単位で決定します。ブランクを含むすべてのサンプルについて、この操作を繰り返します。

次に、測定したT1またはT2緩和値の逆数を算出し、プロットします。これらの値を、ミリモル単位のランタノイド濃度に対してプロットし、直線でフィッティングします。このフィッティング直線の傾きが、T1の場合はR1、T2の場合はR2となる緩和能（relax activity）です。

ここでは、メチル化と精製の一般的なスキームを示します。このスキームは、メチル化の一般的な手順と、異なる精製経路を選択する理由を描いたものです。ここでは代表的なルミネッセンス減衰プロットを示しており、減衰の自然対数を時間に対してプロットしています。水溶液および重水溶液から得られた同様の曲線によって生成される直線の傾きを式1に用いることで、ガドリニウム含有錯体の水配位数を決定します。

リビティ測定の代表的な例をここに示します。フィッティング直線の傾きがサンプルのT1リビティとなります。プロトコルで説明した水の配位数およびリビティの特性評価に加えて、標準的な化学的手法を用いて最終生成物の特性を評価することも重要です。化合物の同一性は質量分析法を用いて確認でき、ガドリニウムおよびオピウム含有錯体に特徴的な同位体パターンを示す代表的なマススペクトルをここに示します。

この手順に続いて、得られた錯体をさらに特性評価するために、ENDOR分光法、HPLC、元素分析などの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、生体高分子のタグ付けに使用できるランタノイド含有錯体の合成、精製、および特性評価の方法について十分に理解できたはずです。