インフルエンザウイルスリボ核タンパク質複合体の精製と可視化

本手順では、まず遠心分離によってインフルエンザウイルス溶液から不純物を除去します。次に、界面活性剤を用いてウイルス膜を破壊し、放出されたvRNPsをグリセロール密度勾配で分離します。

勾配からの遠心分離分画を回収し、各分画のアリコートを供試します。SDS-PAGEを行い、クマシブルーでゲルを染色してV NPを含むピーク分画を特定します。その後、V NPを含む分画を遠心分離によって濃縮し、精製されたVRPを銅製TEM試料グリッドに滴下し、透過型電子顕微鏡でVRPを可視化するためにネガティブ染色を行います。こんにちは、私はブリティッシュコロンビア大学動物学部のNellie Pane博士の研究室のWinCo Wuです。

Paneラボに所属していたリンジー・ウィーバーです。本日は、ウイルスリボ核タンパク質複合体であるインフルエンザの精製手順について説明します。当研究室では、組織培養細胞におけるインフルエンザAウイルスの核移行を研究するために、この手順を用いています。

それでは、始めていきましょう。まず、11 mm × 34 mmのBeckman社製ポリカーボネート製遠心チューブに、MNTバッファーを750 µL分注します。次に、2 mg/mLのインフルエンザAウイルス溶液を500 µLチューブに加え、ピペッティングを数回繰り返し、ウイルスとMNTバッファーを混合させます。

混合後、チューブをTLA one 20.2ローターにセットし、Beckman Optima max E遠心機を用いて4°C、109,000 ×gで10分間遠心分離します。遠心終了後、上清を除去し、ペレットを500 µLのdisruption bufferで再懸濁します。再懸濁したペレットを激しくボルテックスし、その後、Eppendorf ThermoMixerを用いて31°Cで20分間振盪します。

振盪が完了したら、グリセロール密度勾配沈降速度遠心分離に進みます。グリセロール勾配を調製するため、Beckman UltraClear 13 mm × 51 mm遠心管に、70% (v/v) GLYCEROL 1 mL、50%グリセロール 0.75 mL、40%グリセロール 0.375 mL、および33%グリセロール 1.8 mLを順に分注します。これらのグリセロール溶液は、純粋なグリセロールをNMバッファーで希釈して調製します。

また、グリセロールとバッファーの両方を含むバランスチューブを準備します。次に、破砕したウイルス試料を再度ボルテックスし、グリセロール密度勾配にロードします。チューブをBeckman MLS 50スイングバケットローターにセットし、4 °Cで217,000 ×gにて3時間45分間、密度勾配を遠心分離します。

遠心分離の完了後、チューブの上部から250 µLずつグラジエントを分注して回収します。回収した分画は氷上または4 °Cで保存してください。分画の回収後、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて解析を行います。

SDS-PAGE解析を開始するには、各フラクションから20 µLを新しいチューブに分取します。次に、5倍濃度のSDS-PAGEサンプルバッファーを5 µL加え、サンプルを95 °Cで5分間加熱します。加熱後、サンプルを短時間遠心し、10%ポリアクリルアミドゲルにロードします。その際、ウェルの1つに分子量マーカーを含めてください。次に、ブロモフェノールブルーのローディングダイがゲルの底部付近に達するまで、サンプルを電気泳動させます。

SDS-PAGE装置からゲルを取り出し、クマシーブルーで染色します。染色結果に基づき、主にインフルエンザのヌクレオプロテインを含む画分を特定します。

インフルエンザA型ウイルスのNPは約56 kilodaltonsのサイズであり、ウイルスリボ核タンパク質複合体中に存在する主要なタンパク質です。そのため、vRNPを含む分画において、NPのバンドは一般的に最も強いバンドとして現れます。次のステップでは、これらのvRNP分画を濃縮します。

主にNPを含むグリセロール分画を合わせ、Beckman社の11 mm × 34 mmポリカーボネート製遠心チューブ2本に分注し、各チューブにエチルピロカーボネートまたはDEPC処理済みの超純水を満たします。次に、ピペッティングを数回行い混合します。チューブをBeckman TLA 120.2ローターにセットし、4°C、157,000 ×gで4時間半、遠心分離を行います。

遠心分離が完了したら、上清を除去し、ペレットを再懸濁します。精製したV NPsを50 µLのDEPC処理水で分注し、1アリコートを取り分けて、残りは-80 °Cで保存します。これで、VRPsのネガティブ染色を行う準備が整いました。

精製したVRNP 1 µLを、調製直後に2回ろ過したPBSバッファー 9 µLで希釈し、銅製TEM試料グリッドを30秒間グロー放電処理します。このグリッドには、あらかじめParlow Dionおよびカーボン膜がコーティングされています。グロー放電処理直後の試料グリッドをピンセットで保持し、希釈したVRNP 5 µLをグリッド上に滴下します。

待機している間に、ドロップを8分間グリッドに吸収させます。トレイにパルファン（吸収紙）の小さなストリップを置き、そこにPBSバッファーを10 µLずつ2滴と、1%アンモニウムメリデートで構成される調製直後の染色液を80 µL滴下します。次に、試料グリッドを2滴のPBSに注意深く浸し、計1分間洗浄します。

次に、ろ紙を用いて、試料グリッドを乾燥させないように注意しながら、試料溶液の一部を吸い取ります。試料グリッドからバッファーの最後の一滴を吸い取った直後に、試料グリッドを染色液の液滴の中に完全に浸します。そのまま1分間待ちます。

1分後、新しいフィルターペーパーを用いて、 specimen gridから染色液を完全に吸い取ります。観察前に、specimen gridを数分間自然乾燥させます。透過電子顕微鏡下での、陰性染色されたV npsの代表的な透過電子顕微鏡画像を以下に示します。

こちらでご覧いただけるように、V NPSは長さが不均一な棒状の粒子であり、その長さは約30 nanometersから120 nanometersです。オリゴマーNPはNP分子の鎖として構成されており、それがさらに折り畳まれて二重らせんの繰り返し構造を形成しています。そのため、これらの棒状粒子の両端にループが見られることがあります。

インフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体（vRNP）の精製および可視化方法について解説しました。この手順を行う際、陰性染色に酢酸ウラニルを使用する場合は、vRNPの希釈にPBSを使用しないことが重要です。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。