タンパク質の精製で使用するための自​​動化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムの選択

本手順の全体的な目的は、BioRad DUO flow 中圧液体クロマトグラフィーシステムを用い、自動スカウティング法によって、リコンビナントタンパク質の精製に最適なHI液体クロマトグラフィーカラムを選定することです。まず、必要なバッファーおよび目的のリコンビナントタンパク質を含む細菌ライセートを調製します。次に、duo flow クロマトグラフィーシステムの物理的な設置と配管を行い、スカウティングプロトコルの準備を整えます。

次に、サンプルをロードし、プログラムされたHIカラムスクリーニング法を実行して、分画サンプルEITを回収します。最後に、EITを分析し、観察された分離特性に基づいて最適なHIカラムおよび充填剤を特定します。最終的に、DUO flow自動HIカラムスクリーニング機能を用いた中圧液体クロマトグラフィーによる目的タンパク質のスケールアップ精製に最適なHIカラム充填剤を示す結果を得ることができます。

手動のカラムクロマトグラフィーを連続的に行うなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、プロセスを自動化することで変動が抑えられ、再現性の高い結果が保証されることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、現代の液体クロマトグラフィーシステムの物理的な複雑さから困難を感じる場合がありますが、これらは容易に習得可能です。

十分な練習の後、本手順のデモンストレーションを私の研究室の学生であるOrange StoneとShelly Andersonが行います。まず、以下のバッファーを500 mLずつ準備します。バッファーA1用として200 mMリン酸ナトリウム、バッファーA2用として200 mMリン酸水素ナトリウム、そしてバッファーB2用として4.8 M硫酸アンモニウムです。バッファーB1には脱イオン水を使用します。最適なクロマトグラフィー動作条件を確保するため、各バッファーを脱気してください。システムマキシマイザーがバッファーA1とA2を混合して低塩濃度リン酸溶出バッファーを生成し、バッファーB1とB2を混合して高塩濃度硫酸アンモニウムバッファーを生成します。

スタートバッファー。精製対象のタンパク質を含む細胞溶解液 10 milliliters とバッファーB 2を 10 milliliters 混合し、ロード用のサンプル 20 milliliters を調製します。細胞溶解液サンプル溶液の最終的な硫酸アンモニウム濃度は約 2.4 molar となり、スタートバッファーとほぼ同等になります。

溶液から粒子状物質を除去するため、溶解バッファー混合液を低タンパク結合性の0.45 µmシリンジフィルターでろ過します。システムにロードするまで、サンプルは氷上で保持してください。クロマトグラフィーシステムの物理的なセットアップと配管は、この手順の中で最も複雑な工程の一つです。

ここに示す図に従って、デュオフロークロマトグラフィーシステムをセットアップします。プロトコル全体を通じて十分な量のバッファーが確保されており、チューブが常に浸漬した状態にあることを確認してください。ここに示されるようにサンプルロードバルブとダイナミックサンプルループを配管し、サンプルループをポジション3のサンプルバルブ入口に接続します。

外径1/16インチのピークチューブを、同じ長さのペアで8組用意します。次に、これらのペアを2つのカラム選択バルブのポジション1から8に接続します。UV検出器のランプを点灯させ、すべての検出器が校正されていることを確認した後、図に示すようにフラクションコレクターのストリームスプリッターバルブとスプリッターコントローラーを取り付けます。

ポジション2のフラクションコレクター・スプリッターバルブおよびスプリッターコントローラーは、クロマトグラフィーワークステーションとは独立して操作します。分取比率（percent split）を10に設定してください。ポジション2のフラクションコレクターに取り付けられている標準的なドロップヘッドを、マイクロプレート用ドロップヘッドに交換します。

サンプルループをすすぎ、クロマトグラフィーシステムをフラッシュします。次に、溶出バッファーを1 mL/minの速度でシステム内に手動で流し始めます。High Trap HIカラム（1 mL）をカラム選択バルブの2番から8番のポジションに接続します。

ポジション2のカラム選択バルブを接続しているユニオンを取り外します。上流側のカラムフィッティングをデュオフローに取り付けます。空気がすべて抜け、大きな緩衝液の滴が現れるまで、溶出緩衝液をフィッティングに通します。

次に、カラム入口に接続されているストッパーを取り外し、低塩濃度バッファーを多めにカラム上部に滴下します。その後、カラムを上流側のフィッティングに取り付けます。出口側を、下流側のカラムフィッティングおよび選択バルブチューブに接続します。

背圧制限を40 PS.Iに設定します。流速1 mL/minで、カラム体積の5倍量（5 CV）の溶出バッファーを用いてカラムを洗浄します。続いて、流速1 mL/minで、カラム体積の10倍量（10 CV）の開始バッファーを用いてカラムを洗浄します。

pH、UVトレーシング、および背圧が安定したら、カラム選択バルブを手動でポジション1に切り替え、バッファーの流れを停止させます。サンプルをロードするには、サンプル導入チューブを20 milliliterのサンプルに浸します。その後、サンプルループロード洗浄バルブをポジション1に、サンプルロードバルブをパージに切り替えます。

サンプルループ充填ポンプを作動させ、サンプルがサンプル充填バルブに到達した直後まで、1 mL/minの流量でサンプルをポンプチューブ内に吸引します。サンプル充填バルブをパージ（purge）からロード（load）に切り替えます。バイオロジックソフトウェアのセットアップウィンドウから、サンプルループに10 mLのサンプルが吸引されるまで、サンプルループ充填ポンプを1 mL/minの流量で再始動させます。

本表でアスタリスクが付いているシステムデバイスを選択してください。次に、アッセイプログラムに使用するHICカラムを6本選択します。線形降下塩濃度勾配および6カラムスカウティングメソッドにより、開始バッファーの流量を1 mL/minで手動で開始します。

スプリッターコントローラーのスタートボタンを押し、90%から10%へのEITストリーム分割を開始します。プログラムメソッドのランを開始した直後に、オフライン96ウェルプレート分画回収機のオンスクリーンコントロールパネルでスタートボタンを押してください。リアルタイムディスプレイを確認し、想定されるランパラメータであることを確かめます。GFP特異的な397 nanometerの吸光度トレーシングを、一般的なタンパク質の280 nanometerの吸光度トレーシングと比較し、スクリーニング中の異なるHI培地を用いた相対的な分離および精製度を推定します。96ウェルプレート分画から5 to 50 µLのアリコートを新しいプレートに移し、ELISAまたはウェスタンブロットで特異的タンパク質含有量を、SDS-PAGEまたはExperianマイクロ流体電気泳動システムで全タンパク質含有量を分析できます。ここに、スクリーニングランにおける代表的な塩濃度勾配導電率およびカラム圧を示します。

高塩濃度バッファーラインから吸引されるバッファーの割合で測定される塩濃度の変化は、HI法の典型的な特徴です。塩濃度が低下するにつれて、カラムに結合していたタンパク質が溶出します。導電率（観測される塩濃度に相当）は、quad techおよびUV検出器の直後のラインで測定されます。塩濃度勾配と導電率チャートの間のオフセットは、バッファーがバッファー入口からシステムを経由して導電率モニターに到達するまでに要する時間を示しています。

サンプルのラン中、システム圧力とpHは比較的一定に保たれます。この図は、全タンパク質のインライン検出による一連のHIカラムスカウティングランのクロマトグラムを示しています。NGFPは、それぞれ280 nanometersと397 nanometersにおける光の吸光度を測定することで達成されます。

各スカウティングランにおけるGFPの相対的な量と分離を概算することが可能です。この図の2つのラインを比較すると、フェンネルFFスカウティングランの画分10、12、14、16、および18の培養チューブを、周囲光または蛍光灯の下、および紫外線管の下で正面と上方の両方向から観察し、特徴的なGFP発光スペクトルを確認したところ、画分14においてGFPが明確に検出されました。いずれのUV画像においても、左側のUVパネルに見られる拡散した青色はUVランプから放出された光です。

これらのラン後のデータは、397 nmでの溶出液の吸光度測定によるGFPのインライン検出結果とよく一致しており、分画14に溶出GFPのメインピークが含まれていることが示されています。本手順に続き、精製したタンパク質の純度や機能的活性に関するさらなる疑問を解消するために、ウェスタンブロッティング、ELISA、原子間力顕微鏡（AFM）、生化学的再構成アッセイなどの他の手法を実施することが可能です。

この手順を実施する際は、メソッド内のいくつかの時点でデュアルフローシステムを手動で制御する必要があることに留意してください。具体例としては、バッファーの補充やサンプルのロード、気泡の確認、および必要に応じた検出ランプのオン・オフ操作などが挙げられます。このビデオを視聴することで、液体クロマトグラフィーシステムを用いて、最適なHIカラムおよび担体の自動スカウティングを行う方法について十分に理解できるはずです。

インラインおよびポスターによる評価分析を行うことで、研究者はその後のスケールアップ精製に適したカラムを選択することができ、また、標的タンパク質の純度と収量を向上させるために他のクロマトグラフィー法と組み合わせることも可能です。