ブロモデオキシウリジン（BrdU）標識と溶存有機の文化に依存しない識別に対する後続の蛍光活性化細胞選別カーボン分解Bacterioplankton

微生物は、水圏環境などの数多くの溶存有機炭素基質またはDOC化合物の分解を媒介しています。DOC変換における微生物の役割を完全に理解するには、その分類学的な同定と機能の同定を同時に行う必要があります。本ビデオでは、水圏環境において特定のDOCプールを変換する遊離細菌または細菌プランクトンの分類学的同定の手順について解説します。

試験環境から採取した水サンプルを処理し、目的の化合物およびブロモデオキシウリジン（BRDU）とともにインキュベートします。BRDUは、新たに合成されたDNAおよび活発に増殖している細胞に取り込まれます。次に、BRDUでラベル化された細菌プランクトンを、Z₂コンジュゲート抗BRDU抗体で標識します。BRDUラベルレベルの高い細菌プランクトンを、蛍光活性化細胞分取（FACS）によって分離します。

次に、分取された細胞からDNAを抽出し、PCR法による16 s ribosomal RNA遺伝子解析の結果に基づいて分類学的同定を行います。こんにちは、私はケント州立大学生物科学科のChen Mao博士の研究室のSteven Robbinsです。本日は、水圏環境におけるDOC分解細菌プランクトンを同定するための、培養に依存しない手法について解説します。

栄養塩の添加後に細菌コミュニティDNAを解析する既存の手法と比較した本手法の主な利点は、非常に活性の高い細菌に解析を集中させ、休眠状態の細胞や増殖速度の遅い細胞を除外できる点にあります。ここでは、特定の1種のDOC化合物を利用する細菌プランクトンの同定について示します。しかし、この方法は、他の単一のDOC化合物や、藻類浸出物などのDLC群を利用する細菌プランクトンの研究にも適用可能です。

それでは、水サンプルを用意して始めていきましょう。DOC分解細菌プランクトンの分析を行う前に、水サンプルを適切に処理する必要があります。ここに示されているサンプルはジョージア州の沿岸で採取されたもので、水サンプルから粗大粒子およびER VREsを除去します。

ペリスタルティックポンプを使用して、回収用カーボーイから孔径1 µmのフィルターを備えたろ過ユニットに水を移します。次に、ろ液を36 mLずつ、新鮮に調製した10%パラホルムアルデヒド溶液を4 mLずつ含む3本の滅菌済み50 mLポリプロピレンチューブに分注します。培養後の細胞を保存するため、室温で2時間インキュベートします。

孔径 0.22 µm の白色メンブレンフィルターを備えたガラス製真空ろ過装置のろ過塔に水を注ぎ、真空をかけて溶液をろ過します。真空フィルターに 10 mL の PBS を通してフィルターを洗浄します。これらのフィルターに陰性対照である旨をラベル付けし、-20 °C で保存します。

実験的な生態系またはマイクロコスムを構築するために、まず、あらかじめ洗浄した1リットルのガラスフラスコ6本に、ろ過済みの水試料を800 millilitersずつ満たします。各マイクロコスムにBRDUを加え、最終濃度を10 micromolarにします。フラスコを手で素早く回転させて混合してください。

各サンプルについて3連でアッセイを行います。したがって、3つのマイクロコスムにモデルDOC化合物を添加します。ここでは、最終濃度が100 nanomolarとなるようにラインをマイクロコスムに添加します。

次に、残りの3つのマイクロコスムに滅菌PBSを加えます。これらは非DOCコントロールとして機能します。すべてのマイクロコスムを、in situ温度である25°Cに設定し、暗所にある100 RPMの振盪インキュベーターに入れます。ここで、0、8、16、24時間の時点でサンプリングを行います。

各マイクロコスムから36 mLを採取し、4 mLの新鮮な10%パラホルムアルデヒドを含む50 mL滅菌ポリプロピレンチューブに入れ、室温で2時間インキュベートして細胞を固定します。次に、保存された細胞を孔径0.22 µmのホワイトメンブレンフィルターでろ過します。真空ろ過装置を用いて10 mLのPBSを通し、PFAの残留物を洗い流します。

直ちにINS in situ免疫検出に進むか、細菌プランクトンへのBRDU取り込みを分析するためにフィルターを-20°Cで保存します。まず、細菌の細胞壁を破壊するために、室温でサンプルフィルターに衝撃を与えます。フィルターをろ過ユニットにセットし、細胞全体を覆うようにリゾチーム溶液1 mLをフィルター上にピペットで滴下し、室温で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、真空吸引を行い溶液を除去します。溶液がフィルターを通過したら、10 mLのPBSを加えて細胞を洗浄し、再び真空吸引を行います。その後、細胞壁をさらに分解させるため、フィルター上の細胞を覆うように1 mLのプロテイナーゼK溶液を加えます。

室温で30分間インキュベートします。PBSで洗浄し、単層DNAを作成します。フィルター上の細胞を覆うように、エキソヌクレアーゼ溶液を1 mL加えます。

37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、10 mLのPBSを真空フィルターに通してフィルターを洗浄します。次に、フィルターの端を切り取り、細胞が存在しない部分を取り除きます。

次に、アルコールで洗浄し乾燥させた表面上で、滅菌ブレードを使用してフィルターを8等分に切断します。サンプルごとに8つのフレームシール培養チャンバーが必要になります。フィルターの8分の1を、組み立て済みのフレームシール培養チャンバーにサンプル側を上にして配置してください。チャンバーの組み立てが完了したら、Roche Intu cell proliferation kitを使用して、in situでBrdU標識細胞を検出します。

定置手順が完了したら、インキュベーションチャンバーからフィルター部分を取り出し、滅菌した表面に置きます。滅菌済みのブレードを用いて、フィルター部分を細かく裁断します。裁断したフィルター片を1 mLのPBSが入った2 mLマイクロ遠心チューブに移し、チューブの蓋をしっかりと閉めてパラフィルムで密封します。その後、振盪インキュベーターに入れ、37 °C、200 RPMで10分間インキュベートします。

インキュベーション後、チューブを固定し、最大速度でボルテックスします。5分間かけて、上清を滅菌済みの15 milliliterポリプロピレンチューブにピペットで移します。その後、フィルターをPBSで再懸濁し、ボルテックスとインキュベーションのステップをさらに2回繰り返し、各サンプルの上清を同じ15 milliliterチューブに順次加えます。

再懸濁した細胞を4°Cで保存します。サンプルは2日以内に分析する必要があります。最後に、細胞を分取し、BRDU取り込みレベルの高い細胞集団を回収します。

ここでは、BD FACSAria フローサイトメーターおよび対応するソフトウェアを使用します。細胞の分取後、BRDU濃縮集団をアッセイして、その分類学的同一性を決定できます。分取した細菌の16 s リボソームRNA遺伝子を増幅するためのフィルターPCRを行うには、分取した細胞を孔径 0.22 µm の白色ポリカーボネートメンブレンフィルターにピペットで滴下し、真空ポンプを作動させます。滅菌済みのブレードを使用して、フィルターの細胞が含まれていない端の部分を切り取ります。

フィルターを各条件に合わせて4等分に切り、3本のPCR反応チューブにフィルター片を1枚ずつ、細胞面をチューブの内側に向けて入れます。PCRグレードの水 45 µLを加えます。フィルター片が完全に水に浸るようにしてください。

次に、Roche illustra pure T ready to go PCRビーズを2個加え、ビーズを溶解しやすくするために短時間ボルテックスします。その後、フォワードおよびリバースの16 s ribosomal RNA遺伝子プライマーをそれぞれ2 µL加えます。

増幅阻害剤を吸収させるためにBSAを1 µL加えるか、あるいは水を1 µL加えます。サーマルサイクラーを用いてPCR増幅を行います。タッチダウンPCRプログラムを推奨します。このプログラムでは、アニーリング温度を1サイクルあたり1 °Cずつ62 °Cから52 °Cまで段階的に下げ、その後52 °Cで15サイクル行います。

臭化エチジウムで染色した1%アガロースゲルによる電気泳動でPCR増幅を確認し、ゲルからPCR増幅産物を切り出し、KaiGen cayo quick gel extraction kitを用いて精製します。PCRゲルの精製後、同一サンプルの増幅産物をまとめます。これにより、精製された16 s ribosomal DNA増幅産物が、多くの分子解析に使用可能な状態になります。

ジョージア州の沿岸地点からサンプルを採取し、本ビデオで説明する手順に従って、ラシン分解細菌を研究するための処理を行いました。ラシンは海洋環境に遍在するポリアモル化合物です。ここで示されるように、海洋細菌にとっての栄養源およびエネルギー源となり得ます。

サンプルの実態分析により、24時間のインキュベーション後、Racine添加マイクロコスムにおいて、FXI蛍光強度が高く、それがBRDU取り込み量と正の相関を示す細菌群が出現したことが明らかになりました。これらの細胞は、高BRDU取り込み細胞（HI）と定義され、主にRacine分解細菌が含まれていると考えられました。HIは認められませんでした。

添加物なしのコントロールでも細胞が検出されましたが、これらはBRDUの取り込みレベルが低い細胞（lii細胞と呼称）のみを含んでおり、主に利用不可能な細菌プランクトンが含まれていると考えられました。回収されたRacine HI細胞は個別のチューブに分注され、その後メンブレンフィルターで回収されました。フィルターPCR後に16SリボソームRNA遺伝子の部分増幅産物が得られ、ゲル電気泳動によって確認されました。

ソーティングフィルターの後、機能性遺伝子のPCR増幅を行うことで、ソーティングされた細胞間の機能的多様性を調べることも可能です。ここでは、蛍光活性化細胞分取（FACS）とBrdU取り込みを組み合わせた手法を用いて、水圏環境における機能的な細菌細胞を物理的に分離し、特定する方法を説明しました。BrdUは有害であるため、この手順を行う際は、常に白衣と手袋を着用してください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。