ReAsH /フラッシュラベルと細胞におけるテトラセンサータンパク質の画像解析

この手順の全体的な目的は、テトラシステインおよび蛍光タグ付きタンパク質を発現している細胞を、色素 flash または ash で標識し、その結果を定量的に分析することです。これは、まず蛍光タンパク質とテトラシステインタグを含む標的タンパク質を搭載したプラスミドを、目的の細胞株に導入することで達成されます。次に、発現したタンパク質を R または flash で標識し、BAL で洗浄して非特異的に結合した色素を除去し、顕微鏡イメージングの準備を整えます。

次に、共焦点顕微鏡を用いて、ashまたはflashおよび蛍光タンパク質のチャネルで細胞の蛍光画像を収集します。最後に、Image Jを使用して画像を解析し、標的タンパク質へのashまたはflashの結合量を定量化します。最終的に、ashの蛍光と蛍光タンパク質の蛍光の相関関係を通じて、細胞内における標的タンパク質へのashまたはflashの結合度を示す結果を得ることができます。

単に標的タンパク質をGFPで標識するなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、局在に加えて、タンパク質の構造変化などの第二の特性を追跡できる点にあります。この手法は、タンパク質の微細構造および機能の分野における重要な問い、例えば、TACの結合または解離能を変化させる構造変化やリガンド結合イベントなどの解明に役立ちます。我々がこの手法を考案したのは、細胞内で形成されるハンチントンタンパク質の微小な多量体がどのように形成されるかを評価したいと考えた時でした。

データ解析の手順は技術的に複雑であり習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。実験手順のデモンストレーションを行います。ステップ1から3までは、当研究室のリサーチアシスタントであるYasmin Ransonがデータ解析を実演します。ステップ4は、当研究室の大学院生であるSevki GaNが担当します。対象となる細胞株に標準的な細胞培養法を用い、トランスフェクション準備済みの生細胞イメージングスライドを用意してください。

目的のTCタグ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションした、接着細胞の培養液を準備します。選択したトランスフェクション法に従い、TCタグへの特異的結合の程度を評価し、また共焦点顕微鏡像を撮影する際のチャンネル間の蛍光漏れ（ブリードスルー）を確認するために、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを設けることが重要です。したがって、2色で観察する場合は、蛍光タンパク質のみ、および可能であればTCタグタンパク質のみなど、単色用のサンプルを必ず準備してください。

ただし、蛍光タンパク質は含めません。トランスフェクションの1〜2日後、細胞を300 µLの予温したHank's平衡塩溶液（HBSS）で穏やかに洗浄します。10 µMの1,2-エタンジチオール（EDT）と1 µMのASHを含む、新鮮な予温HBSSを準備します。細胞からHBSSを除去した後、300 µLのASH培地を穏やかに加え、組織培養インキュベーター内で37 °Cで正確に30分間インキュベートします。

我々の経験では、インキュベーション時間を長くすると背景蛍光が著しく増加します。細胞から標識溶液を緩やかに吸引して除去し、250 micromolarのtwo three dimer、cap propanol、またはBALを含む予熱したHBSS 300 microlitersに置換し、37 degrees Celsiusで15分間インキュベートします。洗浄液を緩やかに吸引して除去し、予熱したHBSS 300 microlitersに置換します。

この洗浄の後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定することも可能ですが、これにより非特異的な背景蛍光が増加することが分かりました。そのため、通常は室温で生細胞をイメージングします。さらに、ラベル化前の細胞固定は、Bial染料の結合を妨げます。

共焦点顕微鏡で細胞のイメージングを開始するには、個々の蛍光色素のイメージングパラメータを設定し、チャンネル間のブリードスルーが無視できる程度であることを確認してください。次に、サンプルの最大蛍光強度が検出器を飽和させないように、光電子増倍管の設定を調整します。最適なイメージング設定が決定したら、サンプル間でそれらの設定を変更しないでください。

スキャン速度を200 hertzに設定し、4回のライン平均を収集し、ピンホール径を1 area unitに設定します。S/N比に問題がある場合は、ピンホール径を広げることができます。ただし、これによりイメージング解像度が低下する可能性があります。

可能であれば、12ビット以上のフォーマットで共焦点画像を取得してください。これにより、定量データ解析の質を最大限に高めることができます。すべてのサンプルについて、蛍光タンパク質チャネルおよびBI arsenalダイチャネルの画像を取得してください。

データの解析には、以下のプラグインを導入したImage Jソフトウェアを使用します。Image Jのバージョンが1.32 Cより古い場合は、以下のオプションをクリックしてください。複数の画像を同時に開けるようにするには、[Edit] ＞ [Options] ＞ [Input/Output] で [Use JFileChooser to open/save] のボックスにチェックを入れます。

OKをクリックします。目的の画像を開いてください。画像ごとにピクセル強度が異なるため、Image Jは各画像について画面に表示されるピクセル強度の最大値と最小値を自動的に定義します。

これは、表示された画像がそのままの状態では比較できないことを意味します。開いた画像がすべて同じスケールで表示されるように、表示するピクセル強度の上下限を物理的に定義してください。これらの値を設定するには、[画像]を選択し、[明るさ/コントラスト]を調整します。

「set」をクリックし、表示する最小値と最大値を定義します。次に、「propagate to all open images」を選択して「okay」をクリックします。あるいは、特定のチャンネルのすべての画像を1つのファイルまたはスタックにまとめて配置してください。

次に、Image Jがすべての画像を自動的に同じスケールに調整します。この操作を行うには、[Image]から[Stacks]、[Images to stack]を選択し、各ファイルに共通する名前を入力して、[Use titles as labels]を選択します。[OK]をクリックしてください。

解析のために、開いているすべての画像を8ビットに変換します。「Image Type」で「8-bit」を選択すると、表示範囲が0から255の範囲に再スケールされます。情報量も失われるため、元の12ビット以上のフォーマットに上書き保存しないことが重要です。

「名前を付けて保存」オプションを使用して、「eight bit converted」という名前の新しいフォルダにコピーを保存します。画像全体におけるbiarzal dye結合の程度を調べる一つの方法は、画素強度相関プロットを作成することです。このプロットでは、一方のチャンネルのすべての画素値を、もう一方のチャンネルの対応する画素値と比較して表示します。

したがって、結合度が高い場合、GFP蛍光強度が高いピクセル位置ではash蛍光強度も高くなります。ピクセルの相関を分析するために、8ビットのREA画像とGFP画像がImageJで開かれていることを確認してください。次に、[Plugins]から[Image Correlator]を選択して、画像相関プラグインを開きます。画像ファイルを「Image 1」と「Image 2」にそれぞれ割り当てます。

次に「OK」をクリックします。結果として表示されるスタックに詳細情報が表示されない場合がありますが、これは正常な動作です。

スタックを scatterplots という名前の新しいフォルダーに保存し、参照しているサンプルと同じファイル名を付けてください。例：Ash GFP Correlation plot。データを表示するには、次の2つのオプションから1つを選択してください。

まず、[process]から[math]、[log]、[auto]を選択し、データを対数形式に変換します。次に、データを視覚的にリスケールするため、[image]から[adjust brightness/contrast]をクリックし、[auto]を選択します。次に、低値のみが表示されるようにデータを視覚的にリスケールし、特殊なルックアップテーブル（LUT）を使用してデータを表示し、カスタムLUTを作成します。

非常にシンプルなLUTを作成するために、画像のカラー編集LUTをクリックします。左上のピクセルをクリックし、黒を選択してください。次に、その右隣のピクセルを選択し、赤を選択します。

次に、3番目のピクセルをクリックし、マウスボタンを押しながら選択範囲を右下のピクセルまでドラッグします。赤色を選択してOKをクリックし、次に白色を選択してOKをクリックします。前述のように、明るさ/コントラストの範囲を0から255に設定し、画像を画面に表示されている状態で固定します。

他のプログラムに画像をコピー＆ペーストするために、RGB形式に変換します。まず、前述の手順に従って、8ビットまたは16ビットの画像を開きます。GFP用のLUTカラースキームを画像に割り当ててください。

画像をクリックして、グリーンLUT（ルックアップテーブル）を割り当てます。ルックアップテーブルのグリーンを選択してください。最後に、コピーする画像を選択し、クリップボードにコピーします。「編集」から「システムにコピー」を選択します。この図は、GFPおよびTCタグを融合させたキナーゼsockを30分間染色した際の典型的な結果を示しています。

HEC 2 9 3細胞を用いたASHの解析において、ASHはTCタグを持つ標的タンパク質に高い親和性で効率的に結合することが示されました。対照的に、本図はGFP融合SARKでありながらTCタグを欠損した対応するコントロールサンプルを示しており、これはTCタグの特異性とバックグラウンド染色のレベルを検証するために不可欠です。この結果は、TCタグを欠く標的タンパク質に対してRHに反応性がないことを示しており、SSH結合におけるTCタグの特異性が裏付けられました。

この手順を行う際は、細胞がコンフルエントになり静止状態になるのを避けることが重要です。そうしないと、細胞内でのV結合に影響が及ぶためです。このビデオを視聴することで、データを定量的に分析するための簡便な方法を十分に理解でき、これらの手法を洗練させることで、データ可視化のための独自のIUTSを構築できるでしょう。