タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム

本手順の全体的な目的は、クローナリティ（単一クローン性）と高い生産性を兼ね備えたバイオ医薬品製造用細胞株を構築することです。まず、目的遺伝子をコードするDNAを宿主細胞に導入（トランスフェクション）します。次に、FACsを用いて高生産クローンを分離し、続いてクローン選択イメージャーによってコロニー形成を記録します。

最終ステップは、高生産性のクローンをスクリーニングし、選択することです。最終的に、逆相HPLCを用いることで、連続培養およびフィードバッチ培養における抗体生産の結果を得ることができます。この手法のデモンストレーションは極めて重要です。なぜなら、ソートおよびpcan 80 dglのステップは、手順に複雑なセットアップが含まれるため習得が困難だからです。そこで、研究室の以下の研究者が、ホスト細胞への導入効果のためのトランスフェクション、コロニー形成の記録のためのソート（Jason Sanders）、およびtecanサンプリング（Russell Kan）の手順についてデモンストレーションを行います。

この手順を開始するには、トランスフェクションの1日前に、ホスト細胞を15 mLの増殖培地とともに細胞培養フラスコに播種します。細胞を37 °C、7.5% CO2インキュベーターで培養します。翌日、トランスフェクション複合体を調製します。まず、滅菌マイクロ遠心チューブ内で8 µgのDNAを無血清増殖培地800 µLで希釈し、穏やかに混合します。次に、ポリスチレンチューブ内で40 µLのlipを無血清増殖培地800 µLで希釈します。

希釈したDNAを希釈したLipofectamineに加えます。穏やかに混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートして、宿主細胞をトランスフェクションに備えさせます。細胞から増殖培地を除去し、血清を含まない増殖培地6.4 millilitersで置換します。

トランスフェクション複合体を1.6 milliliters、フラスコに加えます。フラスコを揺らして、穏やかに混合します。細胞を二酸化炭素インキュベーターにて37 degrees Celsiusで6時間インキュベートします。

6時間後、フラスコに8 mLの増殖培地を加え、二酸化炭素インキュベーターを用いて37 °Cで翌日まで一晩培養します。吸引により培地を除去し、フラスコに新鮮な増殖培地を加えます。一晩の培養後、再び細胞を一晩培養します。

増殖培地を選択培地に変更します。細胞を二酸化炭素インキュベーターにて37 °Cで2〜3週間培養します。トランスフェクションから2〜3週間後、フローサイトメトリーを用いた活性化細胞ソーティングによるクローニングが可能になります。フラスコから細胞を回収し、4 °Cで800 RPM、5分間遠心分離します。

2%牛血清アルブミンを添加した選択培地で細胞を再懸濁します。次に、蛍光標識抗ヒトIgG抗体を加えます。1/20に希釈した抗体を加え、氷上で15～30分間インキュベートした後、冷PBSで2回洗浄し、ポリプロピレンチューブ内で1×PBSを用いて細胞を再懸濁します。

染色された細胞の例をこの写真に示します。BD FACSAriaでの無菌ソートに向けて、各ウェルに200 µLの選択培地を入れた96ウェル細胞培養プレートを準備します。細胞が入ったチューブを無菌的にロードし、BD FACSAriaで解析して、染色細胞と未染色細胞の結果をそれぞれ記録します。

目的の蛍光染色プロファイルを持つ単一細胞を96ウェルプレートに分取するため、ゲートおよび設定を行います。プレートを37 °Cのインキュベーターで2週間培養し、分取後0日、3日、7日、および13日目に、クローン選択用イメージャーを用いて96ウェルプレート内のコロニー形成を記録し、単一細胞由来のクローンが選択されていることを確認して、高生産性クローンのスクリーニングおよび選択を行います。まず、受け側の96ウェルアッセイプレートにおけるサンプルの位置を記録します。次に、ロボット液体ハンドリングシステムを使用して、20 µLの上清分取液を96ウェルアッセイプレートの各ウェルに転送します。サンプル中の抗体産生量は、サンドイッチ法により分析します。

液量操作システムを用いて、以下の方法でヒトIgG検出ELI SAを行います。まず、サンプルと標準品を、あらかじめコード化されたバイオコート抗ヒトIgGアッセイプレートに分注します。プレートを室温で2時間インキュベートした後、PBSで3回洗浄します。

次に、免疫精製ヤギ抗ヒトIgG HRPを1:2000に希釈してプレートに加え、室温で1時間インキュベートします。1時間後、プレートをPBSで3回洗浄し、その後ABTS基質を添加します。

最後に、プレートリーダーを用いて405 nanometersの吸光度でプレートを測定します。この自動プラットフォームを使用した結果、蛍光標識抗ヒトIgGによる染色で示される表面抗体レベルが、細胞の抗体生産性と相関することがわかりました。ここに、表面抗体発現の高い細胞集団から得られた上位2つのクローンについて示すように、比生産性は50から70 picograms per cell per dayの範囲でした。

対照的に、表面抗体発現量が低い細胞集団から作製された上位2つのクローンの抗体生産性は、1細胞1日あたり約20 picogramsでした。さらに、 FACSソートによって構築された細胞株は、手動の限界希釈法でクローニングされた細胞株よりも抗体生産に関して安定していました。手動の限界希釈法で作製された最上位のクローン（クローン1）の比生産性は、80回の細胞分裂を経て培養した後、約30 PCDから約10 PCDまで低下しました。

一方で、FACSソートによって得られたクローン2の最上位サブクローンは、少なくとも100回の細胞分裂後も、約20 PCDの比生産性を維持することができました。蛍光in situハイブリダイゼーションによる細胞染色体上の外来遺伝子挿入部位の同定により、クローン1は表現型Aと表現型Bの混合集団であることが示されました。対照的に、FACSソートされたクローンは、細胞の99.5%が表現型Aである、より均質な集団であると考えられました。このビデオを視聴することで、治療用タンパク質の製造に向けた製造用細胞株の開発方法について十分に理解できるはずです。