によるHIV - 1 V3ループクラウンR2シーケンスの免疫学的に関連する動的第三紀の構造的特徴の評価第一原理折りたたみ

本実験の全体的な目的は、AR foldingを用いてHIVのR2株におけるV3ループ冠ペプチド配列の動的な構造上の好みを評価し、その結果をR2株の既知の中和感度と相関させることです。これは、AR bonniでフォールディングさせるために、R2 V3ループ冠の適切な断片を選択することによって達成されます。第二のステップとしてフォールディングのシミュレーションを行い、R2冠断片のあらゆる可能なコンフォメーションを探索し、最も可能性の高いコンフォメーションをスタックファイルに記録します。

次に、記録されたコンフォーメーションを解析し、中和感受性を説明し得るR2V3クラウンの動的な構造的優先性を決定します。二次構造、優先性、および探索したコンフォーメーションスタックのエネルギー分布に基づき、V3ループの12番目から14番目の位置にある剛直なβストランドへの優先性が示される結果が得られます。こんにちは、ニューヨーク大学医学部薬理学部の研究室からお話ししております、Timothy Cardozoです。

本日は、GP120として知られる免疫原性HIV-1ウイルスタンパク質のフレキシブルループにおけるin vitroタンパク質折畳みの手順をご紹介します。このフレキシブルループは、HIV-1ウイルスの表面エンベロープ糖タンパク質のV3ループとして知られており、その先端部分はV3ループのクラウンと呼ばれています。今回は、この領域の折畳みを行います。

当研究室では、効果的なHIVワクチン設計に向けた有用な経路を特定するために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、in silicoでフォールディングさせるV3ループ配列を選択してください。

当研究室による先行研究では、任意のV3ループ配列の10番目から22番目の位置が最良の結果を示すことが示されています。ICM Pro分子モデリングソフトウェアのグラフィカルユーザーインターフェース（GUI）にある使いやすいプルダウンメニューを使用して、アルメニオ・フォールディング実験を実行します。まず、この配列に対応するペプチドの三次元原子構造をコンピュータの仮想空間内に構築する必要があります。三次元原子構造を構築するには、「File」メニューから「New」を選択します。

これにより、複数のタブが表示された画面が開きます。「peptide」タブを選択し、テキストボックスに配列を貼り付けるか入力してください。「OK」をクリックして、ペプチドの三次元構造を構築します。

構造がICMのグラフィカルウィンドウに表示されます。3次元構造の構築が完了したら、分子力学メニューから「minimize」を選択すると、サイドメニューが表示されます。そのサイドメニューから「global」を選択してください。

これにより、いくつかの入力フィールドと、デフォルトのパラメータが既に選択されたチェックボックスが表示された画面が開きます。必要に応じて、選択を変更して折りたたむペプチドを選択してください。グローバルムーブの回数およびローカル最小値探索（local min call）の回数をそれぞれ変更することで、シミュレーションの長さと精度を調整します。

ペプチドの全原子折り畳み（all atom folding）をすべて選択します。次に、「save movie」を選択して、折り畳みのムービーファイルを作成します。最後に、「apply」をクリックして、グラフィカルウィンドウで折り畳みを開始します。

アルゴリズムはペプチドをさまざまなコンフォメーションに折り畳み始め、それぞれのコンフォメーションについてペプチドエネルギーを算出して記録します。完了後、エネルギー的に最も安定したペプチドのコンフォメーション、およびほぼ同等のエネルギーを持つ代替コンフォメーションが特定され、コンピューター上で可視化されます。ペプチド折り畳みの実行において、GUIを使用することで折り畳みの様子を確認できますが、V3ループクラウンの折り畳みに最適なパラメータ選択を行うことはできません。

この目的のためには、グラフィカルではないコマンドラインからスクリプトを用いてフォールディングを行うのが最適です。スクリプトとは、単に一連のテキストコマンドをドキュメントやテキストファイルに一行ずつ保存したものであり、これらをICMプログラムに自動的に読み込ませ、順次実行することで、コマンドラインスクリプトを用いてV3ループをフォールディングさせます。まず、コンピュータのハードディスク内のローカルディレクトリに保存するためのテキストファイルを作成します。前述と同様に、まずはコンピュータの仮想空間内でペプチドを構築することから始めてください。

次に、シミュレーションに名前を付け、自由変数の数を設定します。ここで言う自由変数とは、フォールディングにおいて回転可能な状態で残されたペプチド中の化学結合のことです。続いて、V3ループの最適なフォールディングを得るために、シミュレーションを実行する時間を指定します。この時間は、前段階で特定した自由変数の数によって決まります。実験におけるコンフォメーション探索の精度を決定するため、各局所安定点（ローカルミニマム）で実行する探索ステップ数を設定してください。

次に、温度最小化、勾配、および確率分布など、先行研究に基づいてシミュレーション用に最適化されたその他のパラメータを設定します。実験パラメータの設定後、フォールディング中に使用するエネルギー計算を指定します。ここでは、Vander Vi's energyをVW internal peptideで指定します。

エネルギーは14で示され、水素結合エネルギーはHB、静電エネルギーはEl、溶媒和エネルギーはSF、エントロピーはENでそれぞれ表されます。探索対象とする優先的な主鎖および側鎖の角度、ならびに開始コンフォメーションを含む最終設定を指定してください。

最後に、計算を実行し、保存するためのコマンドを記述します。スクリプトを記述してテキストファイルとして保存したら、コンピュータのオペレーティングシステムのコマンドプロンプトからそれを実行してください。前述と同様に、ペプチドの最もエネルギー的に安定なコンフォメーションおよび同等のエネルギーを持つ代替コンフォメーションが特定され、コンピュータ上で可視化するためにプロジェクトファイルに保存されます。

計算が完了したら、EEプルダウンメニューから「file open」を選択してファイルを開きます。ワークスペースパネルにある分子の隣のチェックボックスをクリックして分子を表示し、「molecular mechanics stack view」を選択します。フォールディングによる上位ペプチドコンフォメーションのエネルギー順スタックを表示するには、スタックパネルの右下にあるプロッティングツールをクリックして結果をプロットします。

まず、表示されたウィンドウで「OK」をクリックし、次にプロットの中央にある「best confo」タブをクリックします。その後、結果のスタックテーブルの最初の行（検索で見つかった最低エネルギー配座）をクリックします。すると、グラフィカルウィンドウ内のペプチド構造が、最低エネルギー配座に再配置されます。

このコンフォメーションについて、特にペプチドの最初の5残基において、βストランド様またはαヘリックス様の特性があるか解析します。配列のこの領域を選択し、画面左上のスティックアイコンをクリックしてすべての原子を表示させます。次に、エネルギー結果のスタックを解析し、最適なコンフォメーションをプロットする必要があります。

最低エネルギーのコンフォメーションが他のコンフォメーションから大幅に離れている場合、それは構造が硬い傾向にあることを示しています。結果を評価するには、プロジェクトバイアルを開き、[molecular mechanics stack view]を選択します。すると、スタックコンフォメーションの表が表示されます。プロットヒストグラムアイコンをクリックして、スタックコンフォメーションを可視化してください。

最後に、molecular mechanics stack playをクリックしてスタックのムービーを作成し、ここでのフォールディングによって明らかになった構造上の優先性を視覚化します。R2のフォールディングの結果が表示されます。構造はαヘリックスではなく、V3ループクラウンで予想される通りランダムコイルとなっており、特に12番目から14番目の残基のフラグメントにおいて顕著です。

V3ループでは、スタック全体にわたって明確なβストランドの構造的優先性が認められ、αヘリックス構造はほとんど観察されません。局所的なβストランド構造は、その伸長した直線的な形状によって認識されます。ここはR2株に見られる特異なイソロイシン-プロリン-メチオニン配列の位置であり、この部位におけるHIV株の中では稀な配列であり、R2の特異な性質の原因であると仮説を立てられています。

さらに、最低エネルギー構造と2番目に低いエネルギー構造との間には、ほぼ3ユニットのエネルギーギャップが見られます。したがって、構造が最低エネルギー構造以外に変動するのは1%未満であり、R2V3クラウンおよび12番目から14番目の位置における局所的なベータストレイン構造は、完全に柔軟であるというよりも、より剛直な構造を持っていることが示唆されます。以上で、ICMソフトウェアに実装されたabioアルゴリズムを用いてV3ループクラウン配列をフォールディングさせる方法と、HIVウイルスのR2ストレインを用いてその結果を解析する方法について解説しました。

例として、本手順を行う際は、V3ループの断片に対応するフォールディングペプチドの配列を慎重に選択することが重要です。また、構造的な優先性とエネルギーに関する結果の解釈については、分子モデラーの専門的な助言を受けることが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。