原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

この手順の全体的な目的は、原子間力顕微鏡を用いて、水性バッファー中のDNAやタンパク質などのバイオ分子をリアルタイムでイメージングすることです。まず、イメージングするバイオ分子を調製し、次に原子間力顕微鏡をセットアップしてFMカンチレバープローブを配置することでこれを達成します。

次に、試料表面と目的のバイオ分子のイメージングおよび解析を行います。最終的に、原子間力顕微鏡を用いることで、緩衝液条件下におけるDNA、タンパク質、および不均一なバイオ分子複合体の一般的なサイズ、量、および組織形態を示す結果を得ることができます。この手法は、分子シャペロン分野における重要な問い、例えばシャペロンと共シャペロンからなる複合体とクライアントのSTO幾何学的構造はどうなっているか、といった疑問への回答に寄与します。

AFMおよびKentレバープローブの調製手順は、物理的な操作に伴う複雑さがあるため、書面による指示だけでは習得が困難な場合があります。そのため、本手法を視覚的に実演することは有益です。手順の実演は、私の研究室の学生であるMorgan ShannonとJohn Gertzが行います。まず、イメージング対象となるタンパク質またはDNA分子を単離し、水性バッファーに懸濁させます。サンプルの純度を確認した後、サンプルをマイカに吸着させやすくするため、氷上でAFM吸着バッファーを用いてインキュベートします。

タンパク質試料には、10 millimolar の HEPES バッファーを使用します。DNA の場合は、10 millimolar Tris (pH 7.5)、10 millimolar 塩化ナトリウム、2 millimolar 塩化マグネシウムからなるマグネシウム含有バッファーが AFM プローブの取り付けに適しています。液体セルプローブホルダーを、対応するカンチレバー設置ドッキングステーションに配置します。

イメージングに使用する窒化物をベースとした鋭いレバープローブの、長く太いカンチレバーを確認します。チップが垂直に保たれていることを確認しながら、慎重にリキッドセルプローブホルダーへ移します。次に、光学顕微鏡下でカンチレバーを観察し、破損がなく、リキッドセルプローブホルダーに正しく装着されていることを確認します。

次に、ニューラルヘッドクランプネジを締めて、a FMヘッドを装置のダブテールアセンブリから慎重に取り除きます。a FMヘッドを反転させ、リキッドセルプローブホルダーをa FMヘッド底部にある4本のピンにしっかりと押し込みます。最後に、a FMヘッドを装置のダブテールアセンブリに慎重に戻します。

サンプルのイメージング前にFMをさらに準備するため、搭載されている光学顕微鏡のノブを回してカンチレバーのチップを特定し、ソフトウェア上の光学コントローラーの上下矢印を調整してカンチレバーのチップに焦点を合わせます。レーザー調整ノブを使用して、レーザーをカンチレバーのチップに合わせます。これはプロトコルの中で最も技術的に困難なステップの一つです。ポジショニングは手動で行われ、精密なノブ調整が必要です。

反射スポットと照明スポットにおけるレーザーを慎重にモニタリングすることで、アライメントを成功させる可能性が高まります。次に、AFMヘッド上のフォトディテクターノブを調整し、フォトディテクターを中央に合わせます。金属製AFM試料ディスクに取り付けられた、劈開直後のマイカシートを、AFMホルダープレート上の磁性試料ホルダーに設置してください。

a FMホルダープレートを回転させ、試料ディスクを初期イメージングの位置に合わせます。装置ソフトウェアのフォーカス面制御を使用して、a FMヘッドをMICA試料ディスクの表面に向かって下げます。MICA表面の明確な特徴またはチップの反射がフォーカスに合うまで、装置ソフトウェアからチューニングアイコンを選択し、カンチレバーのチューニングを行ってください。

推奨されるMSNLまたはSNLプローブの共鳴周波数は20から60 kHzです。MICAサンプルのイメージングには、5%のピークオフセットを選択してください。まず、プローブをMICA表面に接触させ、初期スキャンサイズを10 µm、スキャン速度を1 Hzに設定します。

10 µmの視野の完全なスキャン画像をキャプチャします。次に、スキャンサイズを5 µmおよび0.5 µmに縮小し、それぞれの視野の完全な画像をキャプチャします。装置ソフトウェアの解除アイコンを1回クリックして、プローブを解除します。

目的の生体分子をイメージングするために、調製したサンプル 5 µL を、新鮮な吸収バッファー 45 µL と混合します。0.5 µg/mL の生体分子含有溶液 50 µL を、MICUの表面に直接、注意深く滴下します。サンプル中の生体分子がMicah表面に吸着するまで、5分間静置します。

次に、吸収緩衝液をさらに50から100 µL、液体セルプローブホルダーにピペットで加えます。ピペットチップでプローブ、FMヘッド、またはMICAに触れないように注意しながら、必要に応じてフォトディテクターを再調整し、レーザーをカンチレバーに再アライメントします。その後、装置ソフトウェアを使用して、プローブを再度エンゲージさせてください。

関心領域を特定するために、スキャンサイズを大きくします。イメージングが完了したら、装置ソフトウェアの退避アイコンを数回クリックして、プローブを切り離します。最後に、蒸留水を使用してリキッドセルプローブホルダーと試料ディスクを十分に洗浄してください。

次に、圧縮空気を用いて試します。AFM画像の例をここに示します。マイカ基板は、DNAやタンパク質が吸着可能な分子レベルで平坦な表面を提供します。

生体分子サンプルを測定する前にMICAをイメージングすることで、ネガティブコントロールを得るとともに、イメージングノイズを評価できます。また、これによりカンチレバーが適切に調整されており、その後のサンプルイメージングが成功することへの確信を得ることができます。超らせん構造を持つとされる二本鎖血漿DNAは、その非対称な外観と、それまで特徴がなかったMicah基板上への均一な堆積によって容易に識別されます。

個別の粒子サイズのタンパク質複合体は、Micah基板上でも一意に区別することが可能です。粒子サイズの差はサンプルの不均一性を示しており、タンパク質や複合体の化学量論的幾何構造、または生化学的活性を推定するのに有用です。観察されたタンパク質粒子の全体的な対角形状および一貫した配向が確認されました。

タンパク質はMicah基板上でランダムに配向することが予想されるため、ここではイメージングアーティファクトが示されています。観察されたアーティファクトの考えられる原因は、物理的なチップの異常、またはスキャン速度が速すぎるFMイメージングです。チップコンボリューションにより、X軸およびY軸の高さ測定（Z軸）における絶対長計算は妨げられますが、相対的なXおよびYの測定は、イメージングされたバイオ分子の生物物理学的特性を推定する上で依然として有用である可能性があります。この手順を試みる際は、この基本的なAFM手順に従い、カンチレバーを正確にチューニングし、フォトディテクターをアライメントさせることが重要です。

バッファー交換フローセルの使用を含むその他のステップを追加することで、分子シャペロンがステロイド受容体のDNA応答要素からの解離に影響を与える能力など、さらなる疑問を検討することが可能です。このビデオを視聴することで、緩衝条件下で原子間力顕微鏡を用いてDNAタンパク質や生体分子複合体をイメージングする方法について、より深い理解が得られるはずです。