$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
病原性寄生虫に感染した固定および透過処理された上皮細胞から始めます。
非特異的抗体結合を防ぐためにブロッキングバッファーを追加します。
寄生虫のタンパク質と特異的に相互作用するマウスポリクローナル一次抗体と重ね合わせます。
寄生タンパク質結合一次抗体と相互作用する遠赤色蛍光色素標識二次抗体を追加します。
結合していない抗体を洗浄して除去します。一次抗体に結合する抗マウス抗体でブロックし、宿主タンパク質標識中の交差反応
性を最小限に抑えます。
上皮細胞内の宿主リボ核タンパク質を標的とするマウスモノクローナル一次抗体を添加します。
緑色の蛍光色素標識二次抗体と赤色の蛍光色素結合ファロイジンの混合物を重ね合わせ、宿主タンパク質結合一次抗体とアクチンの標識をそれぞれ促進します。
バッファーで洗浄します。DNA染色含有培地を使用してマウントし、宿主核、寄生虫核、およびキネトプラストに青
色を与えます。
共焦点顕微鏡を使用してサンプルを分析します。二重標識免疫蛍光法は、緑色の宿主タンパク質と赤色の寄生タンパク質を示し、それらの正確な細胞内局在化を可能にします。
UV滅菌された丸みを帯びたカバーガラスを含む24ウェルプレートにLLC-MK2細胞を加え、16時間沈降させます。次に、細胞に感染させるために、T.cruziを含む上清を各ウェルに加え、6時間インキュベートします。次に、感染細胞と非感染細胞を含むカバーガラスをPBSで5回洗浄します。
次に、細胞を2%パラホルムアルデヒドとPBSで固定します。10分後、カバーガラスをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄し、次にカバーガラスを非イオン性洗剤で10分間透過処理します。
5分間のPBS洗浄を3回行した後、カバーガラスをブロッキング溶液中で30分間インキュベートし、続いてマウスモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかでさらに30分間インキュベートします。洗浄後、カバーガラスをブロッキング溶液中の二次抗体とファロイジンとともに30分間インキュベートし、宿主細胞内のアクチンフィラメントを染色します。
次に、カバーガラスをPBSで再度3回洗浄してから、DAPI培地を含む少量の退色防止マウント試薬をスライドの表面に塗布します。鉗子を使用して、気泡の形成を防ぐために、媒体内でカバーガラスをゆっくりと傾けます。
二重標識の場合、前述のようにカバーガラスとブロッキング溶液をインキュベートした後、マウスポリクローナル抗体で30分間インキュベートします。次に、カバーガラスをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄してから、二次抗体と30分間インキュベートします。
次に、3回のPBS洗浄に続いて、ブロッキング溶液で希釈したAffiniPureウサギ抗マウスIgGを使用して2番目のブロッキングステップを実行します。30分後、カバーガラスをPBSで再度洗浄してから、マウスモノクローナル抗体とさらに30分間インキュベートします。
次に、PBSを3回洗浄した後、カバーガラスをヤギ抗マウスIgG2b抗体およびファロイジンとともにインキュベートします。次に、PBSを3回洗浄した後、前述のように色あせ防止封入試薬を塗布します。