$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
密なニューロンネットワークを持つヒト多能性幹細胞由来の分化ニューロンを含む大きな培養プレートから始めます。
これらのニューロンを穏やかなタンパク質分解酵素でインキュベートしてプレートから切り離し、シートとして持ち上げます。
インキュベーションを続けると、酵素は細胞接続を部分的に破壊し、ニューロンネットワークを緩めます。
酵素活性を止めるために培地を追加します。
切り
離されたニューロンを繰り返しピペットで移動させ、互いに分離します。
細胞ストレーナーでニューロンをろ過して細胞の塊を取り除き、個々のニューロンを収集します。
遠
心分離して上清を除去します。それらを成長培地に再懸濁します。
再プレーティングのために、これらのニューロンをポリマーと接着タンパク質でコーティングされたマルチウェルプレートにシードします。彼らの付着を可能にするためにインキュベートします。
ニューロンは、生存を維持するために培地からの栄養素を利用します。栄養レベルを維持するために培地を定期的に交換してください。
さらにインキュベートして、ニューロンの成熟とそれらの間の接続の形成を可能にします。
まず、
分化したニューロンのプレートをPBSで優しくすすぐことから始めます。PBSをプレートの壁に沿って分散させ、細胞に直接分散させないように、細胞を破壊しないようにします。細胞に触れないように注意しながら、皿を傾けながら皿の端からPBSを吸引します。
10センチメートルのプレートあたり少なくとも1ミリリットルのタンパク質分解酵素を適用し、細胞をインキュベーターに40〜45分間戻します。インキュベーション中は、位相差顕微鏡でニューロンをチェックし、ニューラルネットワークがプレートから完全に剥離してバラバラになり始めるまでプロテアーゼ処理を続けます。ニューロンが剥離したら、プロテアーゼ1ミリリットルごとに5ミリリットルの新鮮なDMEM培地を加えて消化を停止します。
血清学的ピペットを使用して、細胞をプレートに対して5〜8回穏やかに粉砕し、圧力をかけすぎないように注意してください。細胞を100マイクロメートルのメッシュを通して50ミリリットルのコニカルチューブに一滴ずつ濾し、さらに5ミリリットルの新鮮なDMEM培地でストレーナーをすすぎます。
卓上遠心分離機を使用して、細胞を1,000 g で5分間回転させます。遠心分離後、コニカルチューブをバイオセーフティキャビネットに戻し、ほとんどの培地を吸引し、細胞を湿らせるために250マイクロリットルを残します。細胞を2ミリリットルの新鮮なDMEM培地に静かに再懸濁し、5ミリリットルの血清学的ピペットの端に通します。
最後に、チューブを2〜3回反転させます。血球計算盤とトリパンブルーを使用して生細胞をカウントし、新鮮なDMEMで細胞を目的の濃度に希釈します。特定の細胞株の要件に応じて適切なサプリメントをチューブに追加し、円錐形のチューブを2〜3回傾けて細胞を穏やかに混合します。
24ウェルプレートからラミニンコーティングを吸引し、PBSで一度すすいでください。PBSを吸引し、凝集を避けるために細胞溶液を8の字の動きで各ウェルに適用します。細胞のプレーティングが終了したら、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%に設定されたインキュベーターに戻します。