Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成
2013年3月5日
多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。
本実験の目的は、マルチタイタープレート形式を用いてヒト多能性幹細胞（H PSCs）をニューロンへと分化させることです。これは、H PSCsの単一細胞懸濁液を回収し、V底96ウェルプレートに播種して、一晩かけて胚様体（EBs）を形成させることで達成されます。
次に、神経外胚葉の形成を誘導するため、EBSを分化培地 containing içeren U字型の超低接着プレートに移します。続いて、ニューロンの伸展を促進するため、EBSをマトリゲルコートしたディッシュに播種します。免疫蛍光染色により、8日目頃には典型的なニューロンマーカーの存在を示す結果を得ることができます。
ヒト多能性幹細胞をニューロンへと分化させるための染色プロトコルは、複雑で手間がかかることが多いです。私たちは、ある種の結果的に、ヒト多能性幹細胞からニューロンを作製するための非常にシンプルな手順を見出しました。
技術的な観点から、既存の手法に対する本手法の主な利点は、実施が容易で迅速であり、費用対効果が高いことです。本手順の提示は、研究室のDr MI Zが行います。書面プロトコルに従い、EB形成培地および分化培地を調製してください。
Matrigelコートプレート上のmTeSR条件下などのフィーダーフリー条件下、または化学的に定義された培養システムを用いて、サブコンフルエントで活発に増殖している状態でヒトPSCを培養します。ステレオ顕微鏡下で滅菌プラスチックピペットチップを用い、自発的に分化したコロニーを機械的に除去します。残った未分化コロニーをPBSで洗浄し、1× ROCK inhibitorを含むAccutaneを用いて単一細胞に消化します。
単一細胞を200 Gで2分間遠心分離してペレット化し、少量のEB形成培地で再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞 titer を測定します。残りのEB形成培地に細胞を追加し、titer を 1 mLあたり40,000から80,000 cells に調整します。
マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルV底プレートの各ウェルに100 µLずつ分注し、1ウェルあたり4,000〜8,000個の細胞となるようにします。プレートをスイングアップ式プレート遠心機にて400 Gで1分間遠心し、すべての細胞をウェルの底に集めます。細胞をインキュベーターに移し、一晩置いてEBSを形成させます。翌日、実体顕微鏡下で確認してください。
EBSを回収し、少量の分量で2 mLの分化培地を含む3.5 cmのバクテリアディッシュに移します。ディッシュを緩やかに回転させて細胞を洗浄します。超低接着U底プレートの各ウェルに、100 µLの分化培地を加えます。
実体顕微鏡下での底部96ウェルプレート。洗浄皿からEBSを少量ずつ96個のU型ウェルに分注します。EBSを4日間インキュベートし、4日目に神経外胚葉が形成されるようにします。
分化培地で細胞を洗浄し、Matrigelでコーティングしたマルチタイタープレート（12ウェルプレートなど）の各ウェルに1つずつ播種します。ニューロンを妨げなく伸展させるため、細胞をウェル内に均等に分散させてください。室温で約10分間、EBSをMatrigelに緩やかに接着させます。
その後、プレートを慎重にインキュベーターに移します。播種したEBSから、今後4日間でニューロンが放射状に成長します。以前、我々は他の多くの報告と同様に、hPSC由来のEBSは、hHPCsを低接着ディッシュに定期的に継代し、凝集塊を再播種するだけで生成できることを示しました。
これにより、通常、細胞サイズに大きな分布が生じます。また、懸濁状態で維持されたEBは凝集しやすく、サイズ不均一性がさらに増大するという問題があります。これを回避するために、ヒト多能性幹細胞（hPSC）を低接着ウェルに播種しましたが、EBは形成されず細胞死に至りました。しかし、細胞生存分子であるY 2 7 6 3 2と、hPSCからのEB形成を促進することが示されているポリビニルアルコールを併用することで、単一細胞のhESC懸濁液から一晩でEBを形成させることが可能となりました。
このマルチタイタープレート形式を用いることで、ウェルあたりの細胞数を調整し、EBのサイズを厳密に制御することが可能になります。従来の手法とは異なり、EBを超低接着96ウェルプレートに転移させた後、F-G-F-E-R-K-T-G、TGF beta SMA two、およびBP SMA one阻害剤からなる低分子カクテルを用いて神経外胚葉の形成を誘導し、その後、細胞をマトリゲル上に播種してニューロン分化を促しました。約8,000個の細胞からEB形成を開始させた場合に、播種したEBから顕著なニューロン突起が伸展するという、最高のニューロン分化能が得られました。
播種後のEB中心部の壊死が軽減され、B rrn three Aやbeta three tubulinなどの感覚ニューロンおよび汎ニューロンマーカーが高発現しました。全体的なニューロン分化効率は、これまでHSCおよびHI PSCの両方に適用されてきた従来の手順と同等であると考えられます。マルチウェル手順において、HESおよびHIPS細胞を含む3つの独立したHPSCラインで検証に成功していますが、一般的に細胞株依存的なばらつきや分化効率の変動を完全に排除することはできません。
この図は、単一細胞として播種され、約60%の効率で分化に成功した、解離後の4日目の単一神経外胚葉細胞を示しています。マルチティッタープラットフォームでのEBSの取り扱いは、最初は多少のトレーニングが必要ですが、時間が経てば非常に簡単であることが分かります。
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概要
この記事では、多孔プレート形式を用いて、ヒト多能性幹細胞（hPSC）をニューロンに分化するプロトコルを紹介します。この方法は、分化を制御しながら、プロセスを簡素化し、迅速かつ効率的にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 幹細胞生物学
- 細胞分化
背景
- ヒト多能性幹細胞（hPSC）は様々な細胞タイプに分化できます。
- 従来の分化プロトコルは複雑で時間がかかることがよくあります。
- ニューロンの効率的な生成は神経科学研究にとって重要です。
- 多孔プレート形式を使用することで、プロセスを効率化できます。
研究の目的
- hPSCのニューロン分化の簡素化されたプロトコルを開発すること。
- 制御された方法で迅速にニューロンを生成すること。
- 研究目的のためのニューロン培養へのアクセスを容易にすること。
使用した方法
- V底96ウェルプレートへのhPSCの収穫とプレートへの播種。
- 一晩かけて胚様体の（EB）形成。
- 分化培地を用いてEBをU字型の超低付着プレートに移す。
- ニューロンの伸展を促進するためにマトリジェルコーティングされた皿にEBをプレートする。
主な結果
- 8日目頃に典型的なニューロンマーカーの存在が観察されました。
- 免疫蛍光によりニューロン分化が確認されました。
- プロトコルを使用することでニューロンの効率的な生成が達成されました。
- この方法は研究における高スループット応用を可能にします。
結論
- 適応されたプロトコルは、hPSCからニューロンを生成する迅速かつ効率的な方法を提供します。
- 多孔プレート形式の利用により分化プロセスが簡素化されます。
- この方法は神経科学における研究能力を向上させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, scalable generation of functional neurons from human pluripotent stem cells in a multi-titre plate format, addressing the need for efficient, reproducible neuronal models in early-stage drug discovery. By eliminating multi-step precursor expansion and using a chemically defined, small-molecule-based approach, it reduces technical complexity and supports mid-throughput screening applications. The method provides a de-risked source of human sensory-like neurons for target validation and phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuroectoderm induction and neuronal differentiation pathways using defined small-molecule inhibition of TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK signaling.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing in a 96-well format, reducing time from pluripotent stem cells to functional neurons to eight days.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces neurons expressing pan-neuronal (beta-III tubulin) and sensory (Brn3a) markers, suitable for screening compounds affecting neuronal maturation or function.
- Operational Value: Compatible with multi-titre plate formats, allowing standardized seeding, differentiation, and readout in V-bottom and ultra-low attachment plates for assay reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrated across three independent hPSC lines (HES and hiPSCs), supporting cross-line consistency for disease-relevant modeling.
- Operational Value: Enables scalable production of neurons for downstream functional assays, including electrophysiology or high-content imaging, without requiring specialized differentiation expertise.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through rapid neuronal differentiation and enabling lead identification via compound screening in a format compatible with automated liquid handling and imaging platforms.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by providing a defined system to study neuroectoderm formation and neuronal outgrowth from pluripotent stem cells.
- Screening: Yields adherent neurons from embryoid bodies plated on matrigel, allowing standardized compound exposure and phenotypic readout in multi-well formats.
- Analytics: Enables quantitative assessment via immunofluorescence for neuronal markers (e.g., beta-III tubulin, Brn3a) at day eight, supporting dose-response and hit confirmation.
- Translational Research: Uses human pluripotent stem cells to generate neurons with sensory neuron characteristics, offering translational relevance for peripheral nervous system targets.
- Enterprise Reuse: The multi-titre plate format supports assay standardization across teams and sites, reducing variability in neuronal differentiation for repeated screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in neuronal differentiation efficiency (~60% in optimized conditions) and marker expression reduces ambiguity in target engagement studies.
- Operational Value: Simple, chemically defined medium with small-molecule inhibitors eliminates need for complex growth factor changes or feeder layers.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in target validation by providing rapid access to functional human neurons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuroscience targets through reproducible, scalable neuronal model generation.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture training for embryoid body handling and multi-titre plate transfers.
- Depends on access to V-bottom 96-well, U-shaped ultra-low attachment, and matrigel-coated plates for embryoid body formation and neuronal outgrowth.
- Necessitates standardization of small-molecule inhibitor concentrations (TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF/ERK) across batches for consistent neuroectoderm induction.
- Adaptation to other neuronal subtypes may require protocol optimization beyond the sensory neuron-biased output observed.
- Limited to adherent differentiation outcomes; not suited for suspension-based or 3D organoid applications without modification.
