モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

本実験の全体的な目的は、さまざまなウイルス学的および生化学的なアプローチを用いて、モデルヘルペスウイルスの溶解複製におけるホストシグナル伝達経路の役割を解析することである。ここでは例として、ヘルペスウイルス gamma HV 68 感染時におけるミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質 Mavs の役割を検討する。まず、急性感染時における Mavs の役割を調べるため、野生型および Mavs ノックアウトマウスに gamma HV 68 を感染させ、急性ウイルス感染を誘導する。

マウスの肺を採取し、サンプルを段階希釈してプレートに播種するプラークアッセイによりウイルス量を測定します。その後、単層細胞上のプラーク数をカウントします。ノックアウトマウスにおいてウイルス量が増加していることは、目的の遺伝子が抗ウイルス的な役割を担っていることを示唆しています。

対照的に、ノックアウトマウスでウイルス量が減少していることは、この遺伝子がウイルス感染に必要であることを示しています。これらの知見を検証するため、マウス胚性線維芽細胞を用いて、in vitroでのウイルスの多段階増殖キネティクスを検討します。野生型およびmavsノックアウトマウス胚性線維芽細胞にgamma HV 68を感染させ、さまざまな時間インキュベートします。その後、細胞を回収し、プラークアッセイを行うことで、野生型細胞とmavs欠損細胞の間で多段階増殖キネティクスを比較します。

これらの知見をさらに検証するため、野生型およびmavsノックアウトマウス胚性線維芽細胞にgamma HV 68を感染させます。次に、感染細胞からDNAとRNAを個別に抽出し、ウイルスゲノム転写物をリアルタイムPCRで解析します。私たちは、ウイルス溶菌感染時における宿主免疫経路の役割を研究していた際に、まずこのプロトコルの着想を得ました。

このプロトコルは、他の病原体による感染時のホストシグナル伝達経路の規則を調べるためにも応用可能です。まず、輸送後4日間の馴化期間を設けた、生後6～8週の性別を合わせた同腹マウスを用意し、本手順を開始してください。なお、以下の実験はバイオハザード施設で実施します。

準備として、バイオセーフティーレベル2のキャビネット内で、ラボコート、手袋、マスク、およびシューズカバーを含む個人用保護具を着用してください。感染させるマウス1匹あたり、40〜10,000 PFUのgamma HV 68と30 µLの滅菌PBSを用いてウイルス懸濁液を調製します。

ケタミン・キシラジンを腹腔内注射した後、ウイルス懸濁液を氷上で保持します。足指を挟んで、マウスが適切に鎮静されていることを確認してください。その後、ピペットを用いて、ウイルス懸濁液30 µLを左または右のどちらか一方の鼻孔に滴下します。

ウイルスの肺内への導入を促進するため、マウスを5～10分間側位に保持します。その後、マウスをケージに戻し、鎮静から完全に回復するまで観察します。次に、注射したマウスから肺組織を回収し、感染後数日におけるウイルス力価を評価するための細胞溶解液を調製します。

安楽死させたマウスから採取した肺を、500 µLの1.0 mmジルコニアシリカビーズを含む滅菌済みの1.5 mLスクリューキャップチューブに入れ、氷上に置きます。当日中に次のステップに進まない場合は、サンプルを-80 °Cで保存してください。

それ以外の場合は、冷やした無血清DMEMを1 mL加えます。チューブをビードミルに入れ、スタートボタンを押して肺組織を30秒間ホモジナイズします。これは、サンプルの過熱によるウイルスの不活化を防ぐためです。

30秒間のホモジナイズ後、チューブを氷上で1分以上冷却します。次に、この工程を繰り返します。その後、ホモジナイズした組織を4°C、16,000 RCFで1分間遠心分離します。

遠心分離後、細胞残渣はチューブの底部に、脂質は表面に集まります。ここで示すように、すぐに上清を回収し、NIH 3T3またはBHK 21の単層細胞を用いてプラークアッセイを行います。次に、サンプル中のウイルス力価を決定するためにプラークアッセイを実施します。まず、ウイルス上清を段階希釈してプラークアッセイを開始してください。

まず、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートに270 µLの培地を分注します。1行目は空けておきます。次に、96ウェルプレートの1行目に200 µLの上清を加え、各サンプルを3連（triplicate）で分注します。

次に、1行目のサンプルから30 µLを次の行に分注し、混合します。その後、混合液から30 µLをさらに次の行に分注して混合します。この操作を繰り返し、10倍段階希釈系列を作成します。

次に、希釈したウイルス上清を細胞単層に添加します。24ウェルプレートを使用します。プレートをインキュベーターに入れ、2時間のインキュベーション中、30分ごとにプレートを振ってください。インキュベーション後、細胞のデブリを除去するため、プレートから上清を吸引します。

その後、新鮮な培地で細胞を1回洗浄します。洗浄後、メチルセルロースを含む培地を細胞に加えます。細胞を4〜6日間培養します。

4〜6日後、顕微鏡を用いて各サンプルのプラーク数を計測します。各希釈段階におけるプラーク数を記録してください。

次に、平均値と標準偏差を算出します。プラーク数が多すぎるか少なすぎるウェルは、力価を正確に算出できないため使用できません。したがって、各サンプルについて、プラーク数が7個から70個である希釈段階を使用してください。

1000倍に希釈したこのサンプルのウェルあたりの平均プラーク数は23個です。未希釈溶液中のウイルス力価を算出するには、希釈倍率にプラーク数を掛け、さらに1 mLあたりのマイクロリットル数を掛けます。その後、その値をウェルあたりに添加した希釈上清の量で割ります。

この例では、1000 × 23プラーク × 1000 µL/mL ÷ 100 µL ＝ 2.3 × 10⁵ forming units/mLとなります。次に、既知のタイターを持つウイルスストック溶液を使用して、マウス胚性線維芽細胞におけるgamma HV 68の増殖キネティクスを決定します。まず、野生型マウスおよび特定のホスト遺伝子が欠損したマウスの細胞を、24ウェルプレートに10,000 cells/wellの密度で播種します。翌日、各ウェルの培地を0.5 mLの低MOI gamma HV 68懸濁液に交換します。

プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、2時間 incubation を行います。incubation 中、30分ごとにプレートを揺らしてください。ピペットを使用してウイルス懸濁液を除去し、8%胎児牛血清を含む新鮮な完全DM EM 0.5 mLをウイルス感染細胞に加えます。

感染後のさまざまな日にちで、細胞をインキュベーターに戻します。ピペッティングを数回繰り返し、medium end細胞を回収します。それらを滅菌済みの1.5 milliliter遠心チューブに移し、直ちにminus 80 degrees Celsiusで凍結させ、Metsからgamma HV 68を放出させます。

凍結・融解サイクルを3回繰り返します。細胞を37 °Cに置いて融解させます。その後、ボルテックスミキサーで攪拌し、再び-80 °Cのフリーザーに戻します。

ホスト遺伝子またはウイルス遺伝子の欠損によってDNAまたはRNAの複製が影響を受けるかを確認するため、先に示したNIH 3T3またはBHK-21の単層細胞を用いたプラークアッセイによりウイルス力価を測定します。感染後さまざまな日数の感染細胞から開始し、上清を除去して、細胞を冷PBSで洗浄し、トリプシンで細胞を剥離させます。次に、室温で1000 RCFにて1分間遠心分離して細胞をペレット化し、遠心後に上清を除去して、細胞を-80°Cで保存します。

宿主およびウイルス由来の全DNAおよびRNAを抽出します。次に、スピンカラムを遠心分離します。全DNAとウイルス溶菌転写物特異的なプライマーを用いて、リアルタイムPCRを行います。

ホストのハウスキーピング遺伝子（β-actinなど）を基準として、細胞内gamma HV 68ゲノムの相対量を決定します。全RNAとoligo DTプライマーを用いてcDNAを調製します。上記cDNAおよびプライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、ウイルス転写物の相対量を決定します。

ホストのハウスキーピング遺伝子の参照に対し、ここで示すように、Mavsはmitochondrial antiviral signalingの略称です。Mavsアダプター分子は、細胞質内のRIG-I様受容体からのシグナルを伝達し、NF-κBおよびインターフェロン調節因子（IRFs）を活性化させ、その結果、前炎症性サイトカインおよびインターフェロンの遺伝子発現を上方制御します。ここでは、γHVに感染した野生型マウスおよびそのリターメイトであるMavs欠損マウスの肺におけるウイルス量を示しています。

Mavsの欠損により、感染10日後の肺におけるウイルス量がいずれも著しく減少しており、in vivoでの効率的なウイルス感染にはMavsが必要であることが示された。本図は、野生型マウス胚性線維芽細胞およびMavs欠損マウス胚性線維芽細胞におけるウイルスの多段階増殖曲線を示している。Mavs欠損マウス胚性線維芽細胞ではウイルスの増殖が著しく遅延しており、in vitroでの効率的なウイルス複製にMavsが必要であることが示唆された。γHV68感染マウス胚性線維芽細胞におけるウイルス溶菌遺伝子のmRNAレベルをリアルタイムPCRで解析したところ、Mavsの欠損により、3つの必須溶菌遺伝子のmRNAレベルが著しく減少していた。

これらの結果は総じて、Mavsがgamma HV 68の転写活性化および溶菌性複製に必要であるという結論を支持しています。このビデオを視聴することで、VOおよびVevoの両方において、宿主と病原体の相互作用を複数のレベルで解析する方法について十分に理解できたはずです。病原体を扱う際は、極めて慎重な対応が必要であることを忘れないでください。

操作中は、個人用保護具の着用などの予防措置を講じてください。