からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコル

本手順の全体的な目的は、異常個体の標本の中腸および唾液腺部位から、マラリア原虫および蚊のDNAを抽出することである。まず、蚊の腹部と胸部の接合部を正確に切断し、中腸と唾液腺部位を分離させることでこれを達成する。次に、各部位を脱イオン水中で個別に研磨し、破砕する。

次に、組織懸濁液をアルカリ処理および洗浄し、細胞ペレットを回収します。最後に、細胞ペレットを再懸濁して加熱し、DNAを抽出します。最終的に、PCRおよびアレル特異的制限酵素消化を通じて、異常の特定、媒介種、およびマラリア感染の遺伝子型の判定にテンプレートとして使用するのに適した、高品質な蚊およびマラリア原虫のDNAを得ることができます。

したがって、有機抽出や分取法などの既存の手法に対するこの非常にシンプルな手法の主な利点は、安全で容易に入手可能な試薬を極少量しか使用せず、処理時間も大幅に短縮できる点にあります。蚊の解剖を始めるには、蚊を小さなパラフィルムの上に置き、解剖顕微鏡で固定します。その上に脱イオン水を1滴滴下して覆います。

組織を軟化させた後、蚊の死骸の胸部と腹部の接合部を正確に切断します。これにより、腹部セクションから頭部と胸部を切り離します。解剖した各蚊のセクションを、蚊の個体識別番号と体の部位をあらかじめ記入した、清潔なオートクレーブ済み1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。パラフィルムを廃棄し、70% alcoholを浸したKim wipeを用いて顕微鏡ステージを慎重に拭き取ってから、次の蚊の処理に移ります。蚊のDNAを抽出するために、まず20 microlitersの脱イオン水をサンプルチューブにピペッティングします。

次に、ピペットチップを用いて、浸漬させた蚊の切片をすり潰し、均一な懸濁液にします。サンプルホモジネートに、オートクレーブ滅菌済みのXPBS 1% saponin溶液を100 µL加え、緩やかにボルテックスして混合します。サンプルを室温で20分間インキュベートします。

次に、20,000 Gで2分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを100 µLの1x PBSで再懸濁します。その後、再び遠心分離を行います。

滅菌脱イオン水 75 µL と 20% (w/v) Cellex 100 樹脂脱イオン水懸濁液 25 µL を加え、ブンゼンバーナーで火炎滅菌した滅菌済み 23 ゲージ皮下注射針を用いて、ペレットを再懸濁させるために緩やかにボルテックスします。サンプルチューブの蓋に穴を開けます。

試料懸濁液をヒーティングブロックで10分間沸騰させます。20,000 Gで1分間遠心分離し、DNA溶液をラベル付きの保存バイアルに移します。この溶液をPCR反応のテンプレートとして使用し、抽出したDNAの品質確認、および400 bpの断片が生じると予想される節足動物ミトコンドリアのnicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit four遺伝子の領域を増幅させます。次に、Ananais Gambia種を識別するために、インタージェニックスペーサー領域のSNPを挟む領域を増幅させ、Ananais Gambia Sens Strictoでは390 bp、ananais apiでは315 bpのサイズが生じることを確認します。

次に、p. falciparumの抗葉酸剤耐性多型を遺伝子型判定します。アミノ酸コドン16、51、59、108、および164を挟む領域を増幅するためにネステッドPCRを行います。寄生虫のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子において、増幅産物の対立遺伝子特異的消化を行い、抗葉酸剤耐性を検出します。

関連多型。2%AROSゲル電気泳動で反応を確認します。蚊のDNA抽出物の品質分析、RABIS分子同定、および p falciparum ジェノタイピングのPCRアッセイ結果の例では、簡略化されたKelex法が、標準的な塩析プロトコルよりも工程数が少なく、時間は4分の1以下であるにもかかわらず、それぞれの抽出物において同等のDNA品質で同様の結果が得られることが示されています。McNearのカイ二乗検定に基づき、アノフェレス属やガンビア近縁種に関するサンプルの陽性率、および寄生虫感染率に統計的な差がなかったことは驚くべきことではありません。

反応混合液にBSAを添加すると、簡便法および標準的な塩析法の両方のkelexプロトコルにおいてPCR阻害剤が除去されるため、PCR陽性率が全般的に向上します。しかし、kelex抽出物のDNA品質を除き、この増加に統計的な有意差は認められませんでした。p falciparumアンプリコンを対立遺伝子特異的な制限酵素で消化する手法を習得すれば、中腸および唾液腺におけるマラリア感染の薬剤耐性対立遺伝子のジェノタイピングが可能になります。

適切に実施すれば、この手法は約37分で完了させることができます。