HOエンドヌクレアーゼの形成の定量と分析でアニーリングシングルストランドによる染色体転座を刺激サッカロマイセスセレビシエ

この手順の全体的な目的は、二倍体出芽酵母細胞における単鎖アニーリングによる転座形成の遺伝的制御を明らかにすることです。まず、特定の遺伝子型の単一コロニーを培養し、一晩増殖させます。次に、培養液にガラクトースを添加することで、hoエンドヌクレアーゼにより2本の染色体において同時に二本鎖切断を誘導します。

次に、これらの培養液を希釈し、選択培地および非選択培地に塗布します。最終ステップでは、選択培地および非選択培地で形成されたコロニー数を数えることで、転移頻度を決定します。最終的に、異なる遺伝子型の株におけるho誘導性の転移形成頻度の変化を通じて、一重鎖切断による転移形成の遺伝的制御を示す結果を得ることができます。

DNA二本鎖切断と転座形成はこの治療の主な結果であるため、本手法の意義は、がん患者への治療放射線照射の影響へと広がります。ho誘導転座頻度を決定する手順を開始するには、目的の遺伝子型のシングルコロニーを、Y培地（グリセロール・乳酸培地）1 mLの独立した10〜20本の培養管に接種し、30 °Cのローテーターで一晩培養します。培養物が目的の細胞密度に達したら、最終濃度が2%となるように20%ガラクトースを添加します。ガラクトースによりhoエンドヌクレアーゼの発現が誘導され、染色体3のhis3-delta5'アレルおよび染色体15のhis4-delta3'アレルにおける二本鎖切断が誘導されます。その後、30 °Cのローテーターで4時間培養します。

次のステップは、この手順を成功させるために極めて重要です。培養液を慎重に希釈し、平板播種することが不可欠です。異なる遺伝子型の株間で統計的に有意な比較を可能にする十分な再現性のある転位頻度を得るためには、4時間後、培養液を適切に希釈し、ヒスチジン欠損培地およびYPD培地に、1プレートあたり約100から200コロニーとなるように播種します。プレートを30 °Cで2から3日間インキュベートしてください。

コロニーが出現した時点で、転座頻度を決定できます。hoエンドヌクレアーゼ発現の誘導前後のプレーティング効率を確認することで、転座したいずれの染色体の有無が、DSB形成後の生存能力に影響するかを判断できます。誘導前のプレーティング効率を決定するために、染色体3と染色体15の両方を1コピーずつ断片化します。

まず、一晩培養した各培養液から細胞を分注し、血球計数器を用いて細胞数を測定します。次に、適切な希釈を行い、YPD培地に約100〜200個の細胞を播種し、コロニーが出現するまで30 °Cで2〜3日間培養します。残りの培養液に20%ガラクトースを加え、最終濃度を2%として30 °Cで4時間培養し、誘導後の播種効率を決定します。

誘導から4時間後、各培養液から細胞を分注して採取し、血球計数計を用いて細胞数を測定する。適切な希釈を行い、YPD培地に約100〜200個の細胞を播種し、コロニーが出現するまで30 °Cで2〜3日間インキュベートする。プレート上にコロニーが出現すれば、播種効率を決定できる。転座を保持していると考えられるクローンは、サザンブロットによって解析することができる。

この手順では、各独立した試験から調製した単一のhissプラス組換えコロニー由来のゲノムDNAを使用します。各DNAサンプル約4 µgをBamHI制限エンドヌクレアーゼで消化し、BamHI消化断片を0.7%アガロースゲルで分離した後、正に帯電したナイロンメンブレンに転写します。その後、HIS3遺伝子を含む1.8 kbのBamHIゲノムクローンのランダムプライミングにより得られた³²P標識プローブを用いてハイブリダイゼーションを行います。DNA断片をオートラジオグラフィーまたはホスホイメージングで可視化します。転座を保持していると考えられるクローンを検討する別の方法として、染色体プロット分析があります。

まず、選択したhissプラス組換え体から染色体を調製し、arosプラグを用いて、1%arosゲル上の等電場（CHEF：contour clamped homogeneous electric field）にて14°Cで染色体を分離します。パラメータは以下の通りです。第1ブロック：14°C、スイッチ時間72秒、6 V/cmで15時間。第2ブロック：14°C、スイッチ時間122秒、6 V/cmで11時間。電気泳動の完了後、ゲルをEtBr（臭化エチジウム）で30分間染色して染色体を可視化し、続いてUV照射および蒸留水による脱染色を行います。その後、毛細管現象により染色体を正電荷メンブレンに転写します。

変性条件下で、his3遺伝子を含む1.8 kbのbamH1-bamH1ゲノムクローンをランダムプライミング法によりP32標識して得たプローブを用いてハイブリダイゼーションを行います。オートラジオグラフィーまたはホスホイメージングにより染色体を可視化します。染色体転座の頻度は、ヒスタジン栄養要求性コロニー数を、YPDプレートへの播種により決定した全生存細胞数で除して算出できます。

この例では、算出された組換え頻度は約 3% です。ho 誘導転座頻度のアッセイは、異なる遺伝子型の株を用いて実施することで、単鎖アニーリングによる二重鎖切断の修復能力の差を比較することができ、これはこの代表的なグラフに示されています。RAD 51 デルタヌルホモ接合体で選択的および非選択的に得られた転座頻度は、野生型株を用いた対応する条件で得られた頻度（誘導前および誘導後の播種の両方）と統計的に有意な差がありました。

効率は、生存してコロニーを形成した細胞の総数を、この表に示されている誘導前後の播種におけるヘモサイトメーターによる計数で決定した培養液中の細胞体総数で割ることで決定されます。野生型細胞において効率に有意な差は見られず、これは転座染色体の有無がDSB形成後の生存能力に影響を与えないことを示唆しています。

転位を保持していると考えられるクローンの有無は、ゲノムサザンブロット解析によって確認できます。ここでは、転位形成前後の関連染色体を模式的に示しています。親株および組換え株のゲノムDNAをBamHIで消化した際に生成される、関連配列を含む制限断片のサイズが、1.8 kbのBamHIプローブを用いたハイブリダイゼーションによるブロット解析で示されています。

His3の3つのゲノムクローンが、サザンブロット解析用にキロベースペア（kb）で示されています。ゲノムDNAをBmhI制限酵素で消化し、これらの診断的断片を可視化するために、$^{32}$P標識した1.8 kbのHis3プローブでハイブリダイゼーションを行います。

0.8 kbのHIS3 Δ20、1.7 kbのHIS3 Δ3'、4 kbのT3 15、5 kbのT15 3、および8 kbのHIS3 Δ5'フラグメント。レーンAは親二倍体である。レーンBはHIS+の非相称転座組換え体であり、レーンCはHIS+の相称転座である。

組換え染色体BLO解析は、転座を持つクローンの検討にも利用できます。アロスプラグで調製した完全な染色体をチェフ電気泳動で分離し、ゲルを臭化イリジウムで染色してUVライト下で可視化します。その後、分離した染色体をナイロン膜にブロッティングし、$^{32}\text{P}$で標識した1.8 kilobaseのプローブでハイブリダイゼーションを行います。

1.1 megabaseの正常な第3染色体、15.8 megabaseのT(15;3)転座染色体、0.6 megabaseのT(3;15)転座染色体、および0.3 megabaseの正常な第15染色体を可視化するための3つのプローブを用いたハイブリダイゼーションの結果である。レーンAは親株、レーンBはhis+非相 reciprocal 転座組換え体、レーンCはhis+相互転座組換え体を示している。

このビデオを視聴することで、複数のho刺激による二本鎖切断後の転座形成頻度を決定する方法について、十分に理解できるはずです。