チップ上Lensless蛍光顕微鏡

本手順の目的は、超広視野で蛍光物体をイメージングするための、レンズレス・オンチップ蛍光顕微鏡プラットフォームを実証することです。これを実現するため、薄い吸収フィルターとファイバー optic フェイスプレートを光電センサアレイ（CCDC MOS）の上に慎重に配置し、次にマイクロ流体チップをフェイスプレートの上に設置します。続いて、屈折率整合油を用いて、プリズムをマイクロチップに組み立てます。

蛍光励起は菱形プリズムの側面から行い、ホログラフィック照明は同プリズムの上面から行います。最終的に、取得した蛍光画像をデジタルアルゴリズムでデコードすることにより、高解像度の顕微鏡画像を得ることができます。必要に応じて、デコードされた蛍光物体を独自に開発したインターフェースを用いて自動的にカウントすることが可能です。

オンチップレンズ。イメージング全般の目的は、かさばるレンズベースの光学顕微鏡を、よりシンプルでコンパクトな設計に置き換えることです。この新興の技術プラットフォームは、新しい理論とデジタル再構成アルゴリズムの活用により、かさばりコストのかかる光学部品を不要にする可能性を秘めています。

オンチップイメージングプラットフォームのレンズリストは、デジタルセンサアレイ、非コヒーレント照明光源、プリズム、吸収フィルタ、およびファイバーオプティックフェイスプレートまたはファイバーオプティックテーパを含む、いくつかの光学コンポーネントで構成されています。このプラットフォームでは、標的となる微小物体からの蛍光信号を検出するために、さまざまな種類のセンサアレイを使用できます。本ビデオでは、電荷結合素子（CCD）を使用し、蛍光励起には単純な発光ダイオードなどの非コヒーレント光源を使用します。

この図に示すように、必要な暗視野背景を作成するために、2つの異なる励起フィルタリング方法が並行して用いられています。まず、ガラスプリズムまたはガラス半球を使用して、目的のサンプルを保持するマイクロ流体チップの底面で全内部反射（TIR）を発生させます。これと並行して、安価な吸収フィルターを使用して、TIRプロセスに従わない弱く散乱した励起光を除去します。

これら2つのメカニズムによって励起光が正常に除去されることで、検出器面ではサンプルの蛍光放出のみが取得されます。このような大きな検出開口数であるにもかかわらず、蛍光信号の空間的な広がりを設計し、より適切に制御するために、センサーアレイ上の生の蛍光スポットはかなり広く設定されています。通常のフェイスプレートの代わりに、対物面とセンサー面の間にはファイバー光学フェイスプレートが配置されます。

テーパー形状の光ファイバーフェイスプレートは、底面よりも上面の光ファイバーケーブル密度が大幅に高くなっており、拡大による高解像度イメージングに使用できます。このプラットフォームで使用されるマイクロ流体チップは、ポリジメチルシロキサンを用いて作製されており、ガラススライド上に壁を配置することで、オンチップイメージングに必要なマイクロチャネルを形成します。まず、真空ペンを用いて光電子センサアレイのカバーガラスを取り除き、検出器の活性領域の上部に薄い吸収フィルタを慎重に配置し、レンズレス・オンチップイメージングプラットフォームの組み立てを開始します。

この吸収フィルターの上に光ファイバー面プレートを配置します。次に、作製したマイクロフルイディクチップを光ファイバーアレイの上に直接置きます。続いて、界面の屈折率がガラスの屈折率と一致するように、屈折率匹配オイルを使用して、マイクロフルイディクチップの上にガラスプリズムを組み立てます。

FCコネクタを使用して、光源を光ファイバーケーブルに接続します。この手順で最も困難な点の一つは、各コンポーネントのアライメントです。コンポーネント間の距離、および照明の位置と角度を慎重に調整してください。

最後に、側面照明ファイバーをプリズムに近づけ、マイクロフルイディックチップに対応するガラスと空気の界面で全反射が起こるように角度を調整します。このオンチッププラットフォームを用いて、底面基質、さまざまな細胞、または小動物モデルのイメージングが可能ですが、本デモンストレーションでは白血球をイメージングします。蛍光色素で白血球を標識するために、まず約100 µLの全血に約1 mLの赤血球溶血バッファーを混ぜ、室温で約3分間インキュベートした後、溶血血液溶液を遠心分離します。

マイクロピペットを用いて上層を除去した後、ペレット層をリン酸緩衝生理食塩水で再懸濁し、細胞の核酸を蛍光染料で標識します。再懸濁液にSYTO 16を加え、室温、暗所で約30分間サンプルをインキュベートします。30分後、標識したサンプルを遠心分離します。未結合の染料による蛍光発光に起因するバックグラウンドノイズを低減させるため、上清を除去します。

Reeseは白血球ペレット層を約5 mLのPBSで再懸濁しました。これで、レンズフリーのオンチップ蛍光イメージング用のマイクロ流体チップにサンプルをロードする準備が整いました。白血球のイメージングを行う前に、蛍光マイクロビーズを用いてイメージングプラットフォームのキャリブレーションを行う必要があります。

脱イオン水と未希釈のビーズ溶液を用いて、希釈したマイクロビーズ試料を調製します。鋭い針付きシリンジを使用し、この初期試料をPDMS壁の側面からマイクロ流体チップに注入します。

オンチップ蛍光イメージングを実現するためにコンポーネントを組み立てた後、独自に開発したLabVIEWインターフェースを介して、コンピュータを用いて蛍光ビーズの生画像を取得します。視野全体に少なくとも20個の独立した蛍光ビーズ画像があることを確認してください。後でレンズレス蛍光顕微鏡プラットフォームの点広がり関数（PSF）を校正および抽出するために使用する、校正データを保存します。

蛍光ビーズ試料を含むマイクロ流体チップを取り出し、チップからプリズムを分離します。あらかじめ調製した白血球試料を、未使用の別のマイクロ流体チップのPDMS壁側から注入します。距離および励起強度などの実験条件を同様に揃えて、再度コンポーネントを組み立てます。

蛍光マイクロビーズに使用したものと同じソフトウェアパラメータを用いて、カスタムメイドのLabVIEWで白血球の生画像を取得します。その後、キャリブレーションデータと白血球の生画像を使用して、MATLABでのデジタル処理により高解像度画像を作成します。比較目的として、4 µmおよび10 µmの緑色蛍光粒子を含む混合物の広視野レンズによるオンチップ蛍光イメージングの代表的な結果をここに示します（10倍顕微鏡）。

また、対物レンズを用いて撮影した画像も提供されており、提示したレンズレス蛍光画像と良好に一致しています。次に、10 µmの緑色および赤色の蛍光粒子を含む混合物の、広視野レンズレス蛍光イメージングの結果を示します。このレンズレス蛍光画像は、同一サンプルの10倍対物レンズ顕微鏡画像と十分に一致しています。

この図は、さまざまな10 µmビーズペアのイメージングにおける、Lucy Richardsonデコンボリューションとデコーディングアルゴリズムに基づく圧縮サンプリングの性能比較を示しています。上段はレンズレスの生蛍光画像であり、挿入図は10倍対物レンズを用いて撮影した同一粒子の顕微鏡比較画像を示しています。中段は圧縮デコーディングの結果を、下段はLucy Richardsonデコンボリューションの結果を示しています。DDCSおよびDLRはそれぞれ、中心間距離と顕微鏡画像、CSデコード済みのレンズ画像、およびLRデコンボリューション済みのレンズレス画像を指します。

次に、レンズによるデジタル処理を行い、蛍光強度の低い未処理画像を解析する方法を説明します。圧縮サンプリングに基づくアルゴリズムを用いて、密に配置された直径 2 µm のビーズ対を分解することで、4 µm 未満の空間分解能を実現します。挿入図は 40倍の顕微鏡対物レンズによる比較であり、デコードされた蛍光画像と非常によく一致しています。

ここでDは顕微鏡画像における中心間距離を指します。一方、DCSはCSデコード後のレンズレス蛍光画像における中心間距離を指します。この図は、蛍光標識した白血球のレンズレスイメージングの結果を示しています。

生のレンズレス画像は、CSベースのデコーダーを用いて迅速に復号されます。この結果は、10倍の対物レンズで取得した同一サンプルの従来の顕微鏡画像と非常によく一致しています。必要に応じてイメージングを行うだけでなく、復号された蛍光物体は、オンチップサイトメトリアプリケーション用に独自に開発されたインターフェースを使用して自動的にカウントすることも可能です。ここでは、MATLABで独自に設計された自動蛍光物体カウントインターフェースを示しています。以上で、8 cm²の視野における、ラベル化された細胞およびマイクロビーズのレンズレス蛍光顕微鏡法の procedure を実証しました。

このような比較可能なチップイメージングプラットフォームに、高速圧縮デコーダーを組み合わせています。これにより、ハイスループットサイトメトリー、微量解析、および生細胞研究アプリケーションにおいて非常に汎用性の高い活用が可能になります。