GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

この手順の目的は、生存している血管内皮細胞のアクチン細胞骨格における動的な変化を観察することです。まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞にA GFP beta actinプラスミドをトランスフェクションし、カバーガラス上でコンフルエントになるまで培養します。次に、加熱ステージとアルブミン生理食塩水を注入した生細胞イメージングチャンバーにカバーガラスを設置します。

最終ステップは、薬理学的製剤による処理前後において、選択した細胞領域をタイムラプス画像キャプチャによりデータ収集することです。Image Jなどのイメージングソフトウェアを用いたカイムグラフ解析により、突起の距離、時間、速度などの局所的なラメラポディア突出や、時間の経過に伴うアクチンフィラメントの運動に関する知見を得ることができます。免疫蛍光イメージングなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、生細胞イメージングによって、血管内皮透過性を決定するメカニズムの研究に、アクチンおよび細胞骨格の動的な性質を取り入れられる点にあります。

固定染色細胞は時間の断片的なスナップショットに過ぎず、炎症メディエーターによる処理前後の細胞活動および細胞骨格の動態に関する得られる情報は少ない。バイオセーフティキャビネット内にて、カバーガラスを70% ethanolで2分間滅菌し、その後風乾させる。各カバーガラスを10 cmの培養プレートに配置し、カバーガラスの端に触れないように、中心に300 µLの温めたゼラチン溶液を加える。5分後、液体を吸引除去する。

次に、0.25%トリプシンEDTAを用いて、コンフルエントなヒト臍帯静脈内皮細胞（VE）の培養物を回収します。細胞数を数え、遠心分離により回収してください。VE核エフェクターキットを用いたトランスフェクション反応のため、上清培地を可能な限り吸引して取り除きます。

細胞ペレットをBasic Nuclear Effector溶液で再懸濁し、0.2から2 µgのGFP beta actinベクトルプラスミドを添加します。細胞懸濁液100 µLをNuclear Effector Q-vesselに移します。蓋をしたQ-vesselを数回軽く叩き、Q-vesselの底面とトランスフェクションサンプルの間に気泡がないことを確認します。

Q VETを核エフェクター2デバイスにセットし、プログラムA 0 3 4を実行します。核エフェクターキットのトランスファーピペットを用いて、加温した500 µLのEGM 2 MV培地をqveに添加します。その後、混合液をマイクロ遠心チューブに戻し、15分間インキュベートします。トランスフェクションしたVE懸濁液を静かに1回混ぜ、エッジに触れないように300 µLの懸濁液をゼラチンコートしたカバースリップ上に滴下します。

その後、1～4時間インキュベートします。トランスフェクションした細胞を観察し、カバースリップへの接着を確認してください。次に、10 mLのE GM two MV培地をプレートに加え、GFPの発現が認められるまでさらにインキュベートを続けます。

まず、アルブミン生理食塩水溶液（PSS）を重力流システムに加え、インラインヒーターに接続します。次に、流量調節器を調整し、流量を約40 milliliters per hourに設定します。その後、綿棒を用いてストップコックを閉じ、流れを停止させます。

ダイヤモンドバスの底面にある外縁部に真空グリースを塗布します。次に、インキュベーターからトランスフェクション済みの培養物を取り出します。ピンセットを使用して、カバーガラスをゆっくりと持ち上げます。

次に、キムワイプを使用して、細胞面を上に向けた状態で、底面のスライド上の余分なEGM two MV培地を吸い取ります。カバーガラスの上にダイヤモンドバスを配置してチャンバーを形成します。速やかにチャンバーをステージヒーターに設置してください。

チャンバー上のクランプを締め、プレートから約1 mLのEGM two MV培地をチャンバーにピペットで分注します。次に、真空ホースをチャンバー左側のホルダーに、インラインヒーターからのA PSSラインをチャンバー右側のチャンネルに接続します。その後、真空をオンにし、A PSSラインを開いて、トランスフェクションした細胞にバス灌流を行います。

また、インラインヒーターを37 °Cに設定してスイッチを入れます。次に、加熱ステージ用のサーミスタプローブをバスの端に配置し、ステージヒーターを37 °Cに設定してスイッチを入れます。残っているEGM-2 MV培地や塩の蓄積を除去するため、70% ethanolを浸したKimwipeでカバースリップの裏面を丁寧に拭き、続いて乾いたKimwipeで拭き取ります。その後、トランスフェクションしたHU細胞を30分間平衡化させます。

コースをロックします。解析対象となる培養細胞の選択領域に焦点を合わせます。細胞内のGFP Actinの信号強度に応じて、カメラの露光時間を0.5秒から2秒の間に設定します。

また、実験の間隔時間と持続時間を設定してください。次に、室内の照明を消し、設定を確認するために画像を1枚撮影します。必要に応じて画像を確認しながら、タイムラプス連続撮影を行ってください。

標準的なプロトコールでは、テスト剤を添加する前に20～30分間のベースライン画像を撮影し、その後0.5～4時間の追加画像取得を行います。最後に、付随する本文で詳述するように、CHグラフ解析を用いてラメリポディアの突出距離、持続時間、および速度を評価します。標準的な実験において、GFPアクチンは、トランスフェクションされたVEの50%以上にランダムに発現します。

1分ごとに取得したこれらの画像では、細胞質全体に加え、フィラメント状の構造や、細胞縁に沿って突出する局所的な偽足におけるGFPアクチンが捉えられています。細胞突出の移動距離、持続性、および速度は、タイムラプス画像セットから定量化されます。kym graph解析を用いて、まず、細胞の縁に対してほぼ垂直に1ピクセル幅の線を引きます。

この領域は、タイムラプスセットの各画像から抽出され、時間経過に伴う領域のモンタージュ、またはここに示すようなkymograph（カイモグラフ）を生成するために使用されます。kymographにおいて、左から右への視点で見ると、突出部は細胞縁の上方への動きとして表されます。これらの突出部のいずれかの縁に線が重ね合わされたとき、その線に関連付けられたピクセルデータを収集することで、突出部のダイナミクスを定量化できます。kymographにおける突出部の総数は、突出頻度の推定に使用できます。

この解析では、細胞周辺部に形成され、細胞中心に向かって移動し、最終的に分解されるストレスファイバーの動きを描写しています。kymograph（カイモグラフ）上では、ストレスファイバーは細胞質領域における連続した線として現れ、多くの場合、細胞中心に向かって右下方向へ移動します。元のkymographでファイバーの視認性が低い場合は、アンシャープマスクフィルタを用いて画像を鮮明にします。ストレスファイバー上に線を引くことで、計測機能を用いたピクセルデータの収集が容易になります。あるいは、特定されたストレスファイバーの開始点から終了点まで線を引くことで、ファイバーが観察された期間の平均ピクセルデータを算出します。

このプレゼンテーションでは、Image Jなどのソフトウェアを用いたグラフ解析により、タイムラプス画像セットからデータを分析する方法を実演しました。このビデオを視聴することで、トランスフェクションした内皮細胞のライブセルイメージングを用い、炎症性メディエーターに応答したアクチン細胞骨格のダイナミクスを研究する方法について、十分に理解できるはずです。