デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラット軟膜細動脈におけるエストロゲン受容体-αのイメージング

この手順の目的は、雌ラットの脳から採取した皮質動脈の横断切片を用いて、エストロゲン受容体αの染色と可視化を最適化するための簡便な手法を説明することです。まず、脳表面からEvans blueで染色された皮質動脈を取り除き、セクショニング後にクライオスタットを用いて厚さ8 µmのリング状に切断します。得られた横断切片をスライドガラスに固定し、エストロゲン受容体αに対する一次抗体でインキュベートします。

次に、切片を二次抗体および対比染色剤とともに、dpiを含む封入剤を用いてインキュベートします。最後に、蛍光標識された皮層血管セグメントを撮影し、拡張焦点深度（Extended Depth Focus）ソフトウェアを用いて2D画像に変換します。最終的に、拡張深度ソフトウェアを搭載したNikon免疫蛍光顕微鏡を使用することで、皮層細動脈のエストロゲン受容体アルファを示す結果を得ることができます。

私はMarguerite Littleton Kearney博士です。本日は、私の研究室のポストドクターであるNeil Farani博士が、estrogen receptor alphaの可視化と染色の最適化のための簡便な手順を実演します。対象はpeelです。

Evans blue染料で灌流し、-70 °Cで保存したラット脳の動脈を採取します。解剖顕微鏡を用いて、脳表面の皮質動脈を特定し、微細先端ピンセットで取り除きます。その際、付着している脳組織を注意深く取り除いてください。

動脈を小さな試験管に入れ、氷上に置きます。0.1 MのPBSに含まれる2%冷ホルムアルデヒド溶液中で、動脈を30分間固定します。切片作成の準備として、-20 °Cに設定した凍結ディスク上に包埋剤を注ぎます。

動脈の切片をチャックの上に平らに置き、凍結するまで待ちます。しっかりと凍結したら、クライオスタットの凍結ディスク上の包埋剤の中に、動脈を垂直に配置します。このとき、動脈の先端が前方に向いていることを確認してください。

動脈が完全に凍結するまでピンセットで保持します。動脈を載せた凍結ディスクをクリオスタットのヘッドにセットし、8 µmの厚さの動脈リングをスライドガラス上に直接切片として切り出します。切り出した動脈切片をクロムカリウムゼラチンにマウントします。

2本の筆を使用して動脈リングを真っ直ぐに整え、スライドを固定します。準備したスライドをスライドボックスに入れ、4 °Cの冷蔵庫で一晩保存します。スライドを冷蔵庫から取り出し、ベンチトップ上で室温に戻します。

スライドを1〜1.5 mLの0.1 M PBSで洗浄します。10分後、PBSを排出し、この操作をさらに2回繰り返します。最後のPBS洗浄後、スライドを1 mLの50 mM塩化アンモニウム中で室温で30分間インキュベートします。内因性蛍光を低減させるため、前述と同様に0.1 M PBSで1回10分間として3回スライドを洗浄します。次に、一次抗体の非特異的結合を抑制するため、0.1% Triton X 100および1%正常ヤギ血清を含むPBS溶液中でスライドを30分間ブロッキングします。

ブロッキング後、ブロッキング溶液で1:500に希釈したER alpha抗一次抗体をスライドに滴下し、4°Cで一晩インキュベートします。スライドを冷蔵庫から取り出し、室温に戻します。1〜1.5 mLの0.1% PBSで3回、各10分間洗浄し、未結合の一次抗体を除去します。

各回、スライドをOregon Green, 4 88二次抗ウサギ抗体に含むブロッキング液で、室温・暗所にて2時間インキュベートします。インキュベーション後、0.1 M PBSで1回10分間、計3回スライドを洗浄し、その後、換気付きフードへ移動させます。封入剤（DAPI含有）を試料に1滴滴下し、カバーガラスを被せます。カバーガラスの縁に透明なネイルポリッシュを塗布して封印し、完全に乾燥させます。

染色した維管束切片を載せた調製済みのスライドを顕微鏡にセットし、蛍光標識された目的領域が見えるように調整します。染色されたER alphaの可視化は、本手順の中で最も困難なステップです。受容体が最も明瞭に観察できる維管束の切断面を探してください。

100倍の倍率で開始し、その後600倍まで倍率を上げます。カメラを使用して、細胞核に対するDPIチャンネルおよびDR alphaに対するZIチャンネルで画像をキャプチャし、ソフトウェアを用いて血管セグメントの複数の視野を2D画像に変換します。ここでは、ER alphaの免疫蛍光染色の結果を緑色で、DPIによる対比染色の結果を示しています。

雌ラットの脳から単離した剥離動脈リングにおいて、青色で示されたマージ画像は、核内にエストロゲン受容体αが存在することを示唆しています。Zスタック画像を組み合わせることで、ERα免疫蛍光のフォーカス画像を obtain できます。一次抗体および二次抗体の両方について、自家蛍光陰性対照を用いて検証を行う必要があります。二次抗体でインキュベートしていない動脈の内皮側に沿って、明確な自家蛍光が認められることに注意してください。

このビデオを視聴することで、脳表面から動脈を単離・剥離し、8 µmの横断輪を調製する方法について理解を深めることができます。さらに、蛍光標識したestrogen receptor alphaについて、また、デジタル免疫蛍光顕微鏡とNikonの拡張ソフトウェアを用いて受容体を可視化する方法について習得することができます。