"過酸化"と"酸化"ヒドロキシルラジカルフットプリントにより、RNAの構造における均衡の変化を監視する

本実験の全体的な目的は、ヒドロキシラジカルフットプリンティングを用いてRNA分子がどのように折り畳まれるかを明らかにすることである。これは、末端標識、ゲル精製、およびRNAのプレフォールディングを行うことで達成される。これにより、次のステップであるマグネシウム介在性の折り畳みの前に、RNAの構造的完全性が確保される。その後、フェントン試薬を混合してヒドロキシラジカルを生成させ、溶媒への接近可能性に応じてRNA主鎖を切断させる。次に、RNAの切断産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーによって可視化する。

バンド積分値は、半自動のフットプリンティング解析ソフトウェアによって定量化されます。最終的な目的は、RNAの三次構造形成を反映したフォールディング等温線を作成することです。これは、正規化されたバンド積分値を分率飽和度にスケール変換することで達成されます。

その後、等温線にヒル方程式を当てはめることができます。ヒドロキシフットプリンティングの主な利点は、安価な化学物質を用いてRNAの三次構造情報を得られる点にあります。ヒドロキシラジカルはサイズが小さく活性が高いため、溶媒に接しているヌクレオチドと埋もれているヌクレオチドを区別するための完璧なプローブとなります。この手法は、RNA構造生物学の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

例えば、リボソームはどのように金属イオンを利用して活性形態に到達するのでしょうか。ヒドロキシルラジカルフットプリント法を用いることで、RNAの特異性と認識の基礎を理解することができます。この手法は、RNAの三次構造に関する情報を明らかにするだけでなく、RNAまたはDNA分子における正確なタンパク質結合部位を決定するためにも利用可能です。

この手法における主な課題は、リボヌクレアーゼによるサンプルの分解を防ぐことと、適切な量のRNA切断を得るために鉄濃度を最適化することです。また、バンド間隔の詳細な解析は非常に困難な場合があります。この動画の主な目的は、ヒドロキシルラジカルフットプリント実験の計画段階と、その確実な遂行について視聴者の理解を深めることです。本プロトコルの開始前に、記述されたプロトコルに従い、すべてのフットプリント試薬を準備してください。

このビデオに付随して、そこに概説されている通り、4つの関連するDFOを用いてRNAを合成し、末端標識することができます。変性ゲル電気泳動を用いて、放射性標識したRNAを精製してください。0.3 molar 酢酸ナトリウムを用いて2回連続でゲル抽出を行い、精製したRNAを回収します。

次に、水溶液 0.5 milliliters を 1 milliliter のエタノールと混合し、RNAを沈殿させます。混合物をドライアイス上で 1 minute 間静置します。サンプルを遠心分離した後、上清を捨てます。RNAペレットを 70% ethanol で洗浄します。

追加の遠心分離後に上清を除去し、ペレットを真空中で乾燥させます。次に、精製した $^{32}\text{P}$ 標識RNAサンプルを溶解します。1×反応バッファー 330 $\mu\text{L}$ が入った新しい反応チューブに、RNA溶液 30 $\mu\text{L}$ をピペットで加えます。

エタノールでRNAを沈殿させ、その後、真空状態でペレットを乾燥させます。乾燥後、このペレットは、記載の手順に従ってリファレンスラダーを作成するために使用できます。残りの緩衝RNA溶液を95 °Cで2分間加熱し、変性させます。サンプルを室温で15分間冷却した後、クイックスピンを行い、凝縮物を再び溶液に戻します。フットプリント実験を開始するために、30ウェルの電気泳動ゲルを十分に満たすサンプル数となるよう、27本の反応チューブを準備します。

ラダーと切断コントロールを含めた後、タイトレーションの中点付近で数桁にわたり対数スケール上で等間隔になるように、最終的なマグネシウムイオン濃度を決定します。1倍反応バッファーにおけるマグネシウムイオンの調製については、本文中で別途説明しています。RNAとマグネシウムイオン溶液を50 °Cで5分間インキュベートします。次に、10 µLのRNA溶液を、対応する量の90 µLのマグネシウムイオン溶液と混合します。

最終容量を100 µLにするため、各混合物を50 °Cで30分間インキュベートします。続いて、RNAの折り畳みが起こるよう、25 °Cで1時間静置して溶液を平衡化させます。その間、ヒドロキシラジカルフットプリント反応を開始する直前に、記載のプロトコルに従ってブランク反応ミックスを調製します。

RNA溶液を含む反応チューブの内側上部に、EDTA鉄、アスコルビン酸ナトリウム、および過酸化水素をそれぞれ2 µLずつ、液滴同士が触れないようにピペッティングして、ペルオキシダーゼ反応の準備をします。激しく混合してフットプリント反応を開始します。15秒後、300 µLの純粋な冷エタノールを加えて反応を停止させます。

チューブを3〜5回転がします。最後に、前述の手順に従ってペレットを沈殿させ、洗浄し、乾燥させます。酸化反応の代替案として、酸化ヒドロキシル反応を行う場合は、サンプルの各チューブに、調製直後のFenton反応ミックスを5 µL添加します。酸化反応を25 °Cで30分間インキュベートします。

次に、反応を停止させるために純粋な冷エタノールを300 µL加え、チューブを回転させて混ぜ合わせます。再度、沈殿させます。ペルオキシダーゼ反応または酸化反応のいずれかが完了した後、ペレットを洗浄し、乾燥させます。

乾燥させたRNAペレットを8 µLのゲルローディングダイ2に溶解させます。ガイガーカウンターを用いて、$^{32}$P標識RNAが再懸濁されたことを確認します。標準的なプロトコルに従い、変性8%ポリアクリルアミドシーケンシングゲルを調製します。30ウェルのコームを用い、2つのリファレンスと切断コントロールを含むサンプルをロードします。

60〜75Wで2時間30分間、RNAフラグメントを分離させます。乾燥させたゲルをストレージホスホスクリーンに一晩露光します。フィルムレス自動放射線照写用イメージングシステムを用いて、ホスホスクリーンをスキャンします。

次に、ゲルの画像ファイルを解析用のコンピューターに転送します。データ解析を開始するには、シングルバンドのフィッティングおよび定量化のためのオープンソースソフトウェアであるSafaを開きます。RNA配列を.TXTファイルとして読み込み、続いてゲルの画像を.gelファイルとして読み込みます。

レーンを定義し、バンド強度を調整します。次に、アンカーレーンを選択し、RNA T1消化ラダーを基準として、バンドからヌクレオチドへのゲルアライメント割り当てを行います。バンド強度を定量し、ノーマライゼーション/カラープロット機能を使用して、正規化および不変である可能性のある残基の割り当てを行います。

出力をtxtファイルとして保存します。SFAは、列がゲルのレーンを、行がRNA断片に対応する個々のバンドの積分値を表すスプレッドシートを出力します。まず、マグネシウムイオンを含まないサンプルのプロテクションプロファイルと、最終濃度のマグネシウムイオンサンプルのプロファイルを比較することで、溶媒アクセシビリティに顕著な変化を示すプロテクション部位を特定する必要があります。

値が低いほど、そのヌクレオチドはヒドロキシラジカルによる攻撃からより強く保護されていることを意味し、逆もまた同様です。次に、スプレッドシート形式を用いて、個々のまたはグループのヌクレオチドのバンド強度とマグネシウム・鉄濃度の関係を示す遷移曲線を作成してください。本プロトコルの本文に記載されている通り、これらの遷移を分数的飽和関数に個別にスケールさせます。最終ステップとして、データをHill式に当てはめてフィッティングしてください。

この解析では、転移を分率飽和度でスケーリングして転移の中点を決定し、転移がシグモイド形状であるかどうかの現象論的な検証を行います。以下は、P4-P6 rRNAヒドロキシルラジカルフットプリント実験の代表的な結果です。等温線はSafaを用いて解析したシーケンシングゲルから導出し、解析セクションに記載の方法でフィッティングを行いました。

ゲル画像から、バックグラウンドの切断は最小限であり、T laneにおいてバンドが明確に分かれているため、単一ヌクレオチドの割り当てが可能であることがわかります。ヒドロキシルラジカルによって誘導されたRNAの断片化は、バックグラウンドを十分に上回っています。低濃度のマグネシウムイオンから高濃度への移行は、個々のバンドおよびバンド群の強度の低下と選択的に相関しており、これはRNAの形成を示しています。

三次構造保護とは、切断によってバンド強度が同時に変化する単一または連続したヌクレオチド群を指し、その強度はsaffer解析によって定量化および正規化されます。出力は、ヒドロキシルラジカルに対する保護度を可視化したサーマルプロットです。色の変化はマグネシウムおよび鉄の添加によるアクセシビリティの変化を示しており、白から赤への変化はアクセシビリティが高まったヌクレオチドを、白から青への変化はより保護されたヌクレオチドを示しています。

各シェーディングの段階は数値に関連付けられており、これをプロテクション曲線としてプロットし、ヒル方程式などの結合モデルを用いて解析することが可能です。この例では、protection 1 5 3から1 5 5に関連付けられた平衡解離定数は、protection 1 6 3から1 6 4の対応する値の約2倍になります。このヒドロキシルラジカルフットプリント実験は、適切に実施すれば1日半で完了させることができます。

この手順を行う際は、RNAのコンタミネーションを防ぐため、必ず手袋と白衣を着用してください。また、最終的な鉄濃度は実験系によって異なります。したがって、本手順に従ってフットプリント解析を行う前に、用量反応実験を実施することを推奨します。

さらなる疑問を解決するために、時間分解ヒドロキシラジカルフットプリンティングなどの他の手法を用いることができます。例えば、RNA分子はその形成後、どの臨界時点でミスフォールド状態または活性化した構造に到達するのか、といった点です。この技術は、構造生物学分野の研究者が、核酸の分子内および中間的な三次相互作用を探索する道を開きました。

このビデオを視聴することで、RNA分子の三次構造形成を決定する方法について十分に理解できるはずです。注意点として、手順の実施中は、手袋や保護ゴーグルの着用、およびプレキシガラス製シールドの使用など、危険物に対する予防措置を講じることを忘れないでください。