タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで

タンパク質の試験。タンパク質の機能解析において、タンパク質間相互作用の解明は不可欠です。本ビデオでは、膜に固定化されたタンパク質と可溶性タンパク質の相互作用を試験するための、in vitro タンパク質結合アッセイを紹介します。

まず、融合タンパク質をクローニングし、発現させ、抽出します。タグ付きの不溶性タンパク質をニトロセルロース膜上に固定し、天然の状態の構造にリフォールディングさせる処理を行います。その後、膜をタグ付き可溶性タンパク質でプローブし、免疫ブロッティングを行ってタンパク質を検出します。

タグ付きタンパク質が相互作用する場合、それらは膜上に固定化されたタンパク質によって捕捉され、免疫ブロッティングによるシグナルが観察されます。したがって、このアッセイは、不溶性タンパク質と溶液中のタンパク質との相互作用を検証するための信頼性の高い方法となります。GSTプルダウンなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、不溶性タンパク質と可溶性タンパク質との結合をin vitroで確実に評価できることです。

この手順の最初のステップは、検出のための遺伝子タグ付きタンパク質を作製することです。まず、メンブレン上に固定化するタンパク質をクローニングします。固定化タンパク質をpro Imと定義し、GSTなどの大きなタグをコードする発現ベクターに組み込みます。タグのみをコードする空の発現ベクターを固定化タンパク質のネガティブコントロールとして使用し、これをpro IM ncと呼びます。

次に、可溶性プローブとして使用するタンパク質を、Strep-tag IIなどの異なるタグをコードする発現ベクターにクローニングします。これを可溶性タンパク質の略称としてprosolと呼びます。陰性対照として、陰性対照用可溶性タンパク質を同じ発現ベクターにクローニングします。これを可溶性タンパク質陰性対照の略称としてProsol NCと呼びます。

次に、E. coliやバクロウイルスなどのタンパク質発現システムを用いて、タグ付きタンパク質を発現させます。使用する発現システムは、翻訳後修飾の必要性に基づいて慎重に選択してください。選択した生物から発現したタンパク質を抽出します。pro IMおよびpro I mnc Resusについては、

プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むSDS-PAGE用試料調製バッファーで細胞を懸濁させます。次に、細胞を5分間煮沸し、遠心分離して沈殿物を除去することで、Prosolおよびprosol NCを抽出します。標準的な手順に従ってください。タンパク質はニトロセルロース膜に固定された後にリフォールディングされるため、pro IMSは変性条件下で抽出することが可能です。

ただし、タグ付きタンパク質を抽出した後に結合バッファーに添加するため、天然の状態を確認するためにプロソルを抽出しておく必要があります。BioRadタンパク質アッセイキットなどの標準的な方法を用いて、組換えタンパク質の濃度を決定してください。アッセイに精製タンパク質ではなく粗抽出液を使用する場合の手順は以下の通りです。

クマシー染色したSDSポリアクリルアミドゲルの対応するバンドをスキャニングデンシトメトリーで測定し、目的タンパク質の濃度を推定します。その際、既知濃度のBSAをリファレンスとして使用します。次に、BSAのスキャニングデンシトメトリーで測定された信号強度に基づいて標準曲線をプロットし、粗抽出液に含まれるタンパク質量を算出します。

手順の次のステップは、pro Iamおよびpro IAM NCをメンブレン上に固定することです。まず、pro Iamおよびpro IAM NCの抽出物をそれぞれ1 µgずつ、SDSポリアクリルアミドゲルに二連でロードします。電気泳動後、ガラスプレートからゲルを取り出して100 mLの転写バッファーに入れ、室温で20分間、緩やかに攪拌しながらインキュベートします。

インキュベーション後、ウェスタンブロットを行い、タンパク質をニトロセルロース膜に転写します。転写後、膜に結合したタンパク質をリフォールディングさせます。膜を15 millilitersのバッファーAに入れ、緩やかに振盪しながらインキュベートします。残留したSDSを除去するため、室温で15分間、緩やかに振盪しながらインキュベートしてください。

インキュベーション後、緩衝液からメンブレンを注意深く取り出します。次に、メンブレンを25 millilitersの変性緩衝液に入れます。室温で緩やかに攪拌しながら2時間インキュベートします。

インキュベーション中、ニトロセルロース膜は不透明になります。次に、ピンセットを使用して膜を25 millilitersのTBSに移し、穏やかに振盪しながら5分間インキュベートします。このステップで、膜は元の白色に戻ります。

次に、メンブレンを25 mLの結合バッファーに移します。4 °Cで緩やかに振盪しながら一晩インキュベートします。続いて、可溶性タンパク質を用いて、固定化タンパク質のメンブレン上のプローブを行います。

まず、ハイブリダイゼーションバッファーを調製します。10 mLの新鮮な結合バッファーを含む別々のチューブに、1～10 µgのprosolおよびprosol NCを希釈します。その後、バッファーをハイブリダイゼーションバッグに移します。次に、メンブレンを2本のストリップに切り分け、それぞれにpro IMおよびpro IAM ncを含ませます。

これらの膜をハイブリダイゼーションバッファーに入れます。各膜をprosolまたはprosol NCハイブリダイゼーション溶液に移し、室温で緩やかに攪拌しながら1.5時間インキュベートします。膜をハイブリダイゼーション溶液から取り出し、TBSで15分間の洗浄を3回行います。

タンパク質間相互作用を可視化するために、2.5%スキムミルクを含むTBSTでメンブレンを1時間ブロッキングします。インキュベーション後、ブロッキングしたメンブレンを一次抗体溶液に入れます。ここでは、anti-strep twoポリクローナルウサギ抗体を使用します。

緩やかな攪拌を行いながら、室温で1時間インキュベートします。その後、20 mLのTBSTで15分間、さらに室温で緩やかな攪拌を行いながら5分間を2回、メンブレンを洗浄します。次に、メンブレンをHRP標識二次抗体溶液に浸します。ここでは、HRP標識抗 rabbit IgG抗体を使用します。

室温で緩やかに攪拌しながら1時間インキュベートします。メンブレンを20 mLのTBSTで15分間洗浄し、その後、同様に室温で緩やかに攪拌しながら5分間の洗浄を2回行います。最後にTBSで洗浄した後、HRP化学発光基質（Millipore社製 Molan Western Chemiluminescent）を用いてタンパク質間相互作用を可視化します。

プロソールのイムノブロッティング後、HRP基質を使用します。メンブレンをTBSTで室温にて15分間1回、その後5分間2回すすぎます。次に、タグに対する一次抗体を用いてメンブレンを再プローブします。

続いて、適切な二次抗体を加えます。タンパク質膜オーバーレイアッセイで得られたバンドの同一性を検証するため、化学発光を検出してPRO Iおよびpro Im NNCを可視化します。タンパク質AおよびKと、YFPおよびMP CYFPとの相互作用を、ここに示す本ビデオで説明した方法を用いてタバコ表皮細胞で評価しました。

バイオ分子蛍光相補法により評価したところ、強いYFP信号が再構成されました。このBFC信号は細胞辺縁のPuntaに蓄積しており、MPが極めて不溶性のタンパク質であることを踏まえると、これは細胞膜に存在することを示しています。細菌または植物で発現させた際には、この相互作用を検証するためにタンパク質膜オーバーレイアッセイを採用しました。

1 µgのGST MPまたは非融合GSTを含むin vitroタンパク質抽出液をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、その後ニトロセルロースメンブレンに電気的に転写しました。これらのプロテイン膜を可溶性a nnk strep twoでプローブしたところ、非融合GSTではなくGST mpに結合が認められました。さらに、同一のプロテイン膜を、関連のないpro saw nc IE Arabidopsis Cytoplasmic, NADH kinase tagged strep twoでプローブしたところ、結合は観察されず、A NK MP相互作用の特異性がさらに実証されました。この手順を行う際は、提示されたプロトコルに従い、固定化タンパク質を適切に補充することを忘れないでください。