の血小板媒介クランピングのためのシンプルなプロトコル

本手順では、臨床または研究室由来のPlasmodium falciparum分離株を用いた、血小板介在性凝集アッセイを実施するための標準化されたガイドラインを提供します。まず、感染患者から血液を採取し、遠心分離によって寄生赤血球を回収した後、無性成熟期を培養し精製します。次に、健康なドナーから血液を採取し、遠心分離によって多血小板血漿を調製および標準化します。

凝集アッセイのために、血小板と寄生赤血球の両方を混合します。免疫蛍光顕微鏡による結果から、血小板が介在する P. falciparum の凝集を確認できることがわかります。この手法は、Plasmodium species の凝集表現型を測定するために特別に設計されたものです。

資源が限られた環境における臨床分離株について。現場での凝集酸試験の結果に影響を与える要因として、手順のわずかな変動が報告されています。そのため、マラリア流行地のフィールドサイト間で標準化を図るため、低資源環境に適応した、明確で遵守しやすいプロトコルが必要とされていました。クエン酸ナトリウム配合のvacutainerを用いて、マラリア未感染のホストから約5 millilitersの全血を、またはCMまたはSMマラリア患者から2.5 millilitersの血液を採取します。

全血を室温で250 Gs、10分間遠心分離します。その後、混濁した上清を慎重に清潔な15 milliliterチューブに移します。血小板は温度変化や物理的な衝撃によって容易に活性化することに留意してください。

アノイ・バワーの血球計数器を用いてPRP懸濁液を計数し、PBSで目的の濃度に調整します。その後、PRP分画の一部を1500 Gで10分間遠心分離し、血小板除去血漿（PPP）ペレットとして大部分の血小板を得ます。PRPおよびPPP分画は4 °Cで最大8〜10日間保存してください。凝集アッセイには、なるべく新鮮な血小板を使用することが理想的です。

培養フラスコ内で、ペレット化した末梢赤血球を5〜10 mLのRPMI 1640で3回洗浄します。標準的なマラリア培養培地と新鮮な非感染赤血球をPRBCに補充し、ヘマトクリット値を5%に調整します。培養フラスコ内を92.5%窒素、2.5%酸素、5%二酸化炭素の混合ガスで置換します。その後、密封して、患者由来のPBCから寄生虫を成熟させます。

培養フラスコを37 °C、5% carbon dioxideのインキュベーターで24〜36時間インキュベートします。平らな面に置いたフロステッドガラススライドの一端に、約10〜15 µLの血液を滴下します。2枚目のスライドを45度の角度に保持し、その端を血液の滴に触れさせ、血液が2枚目のスライドの端に均一に広がるまで操作します。

1枚目のスライドに過度な圧力をかけないよう、素早く丁寧に血液を均一に塗布します。次に、血液の薄膜を風乾させ、検体部位をメタノールで10秒間脱水します。その後、再度風乾させ、検体を2% Keemに浸漬させます。

少なくとも10分間保持します。水が透明になるまで十分に洗浄し、風乾させます。光学顕微鏡の100倍油浸レンズでサンプルを観察します。

次に、テキストプロトコルに従って、成熟したPFS parum、PRBCを精製し、同期させます。その後、培養物を清潔で滅菌済みの15 milliliterチューブに移します。室温で370 GS、5分間の遠心分離を行い、細胞をペレット化します。

次に、ペレットを乱さないように注意して上清を吸引します。その後、全量の半分がjello fusingとなるように細胞を再懸濁します。残りの半分については、その3分の1をタンパク質フリー培地、3分の2をpbcsとして加えます。

懸濁液を滅菌済みの15 mLチューブに移し、上層と下層の間に明確な境界ができるまで、37 °Cのインキュベーターで15～20分間インキュベートします。上層を慎重に新しい滅菌済み15 mLチューブに移し、新鮮なRPMIを10 mL加え、370～430 ×gで5分間遠心分離します。その後、上清を慎重に除きます。

次に、先に述べた方法で薄血塗抹標本を作成し、光学顕微鏡下で寄生率と発育段階を評価します。血漿ゲル浮遊法で得られたP RBC懸濁液を、新しい1.5 mLチューブ内で1 × 10⁸ P RBCs/µLになるように調整します。その後、P RBCsをヘマトクリット値5%で懸濁し、最終濃度が20 µg/mLとなるようにアニリンオレンジまたはエチジウムブロマイドを加え、さらに全容量の10%のPRPを添加します。

同様に、PBCの凝集における血小板の役割を確認するため、非感染赤血球、PRP、およびPPPを用いたPRBCの対照群を準備します。次に、懸濁液を2 mLのスクリューキャップバイアルに移します。バイアルを室温で10～12 rpmで回転させ、緩やかに攪拌し、凝集物の形成を確認するため、15～20分間隔で合計120分間サンプリングを行います。

サンプルの10 µLをガラススライドにピペットで滴下し、カバーガラスで覆って蛍光顕微鏡で観察します。3個以上の感染赤血球の凝集塊をクランプとみなします。この実験では、プラズマゲル浮遊法による濃縮後、p FALs パレムの成熟期が約70%含まれる状態でアッセイを行いました。クランプは、通常の光の下でも顕微鏡で容易に見つけることができます。それらは細胞凝集塊として現れ、蛍光下では緑色または赤色のスポットとして観察されます。

それぞれアクリジンオレンジまたはエチジウムブロマイドで染色した際、120分間のインキュベーション後、クランプサイズは平均15 pbc/clump以上に有意に増加し、中には視覚的にカウントできないほど多数のpbcを含むクランプも見られた。クランプ表現型の頻度は、2回の重複アッセイでカウントした感染細胞1000個あたりのクランプ内に存在する感染細胞数として算出した。

このビデオを視聴したことで、Plasmodium falciparumの血小板介在性凝集アッセイの実施方法について明確に理解できたはずです。急激な動作や温度変化によって血小板が活性化しないよう注意してください。このアッセイは、重症マラリアにおける血小板介在性凝集アッセイの測定にも適用可能です。