マウス鋤鼻急性組織スライス標本のイメージングフェロモンセンシング

本手順の全般的な目的は、生体組織内のサブポピュレーションまたは個々のニューロンでカルシウムイメージング実験を行うために、マウスのRO鼻器官またはVNOの急性組織切片標本を作成することである。まず、マウスの鼻からVNOを摘出し、次に解剖顕微鏡下で冷却したA CSF中で軟骨カプセルから微細解剖することでこれを達成する。次に、単離したVNOをアガロースブロックに垂直に配置し、ミクロトームを用いて急性冠状組織切片を作成し、組織の完全性を確認する。

免疫組織化学染色後、共焦点顕微鏡を用いて数枚のスライスを観察します。その他のスライスにはカルシウム感受性色素を導入し、その後、フェロモン候補リガンドを灌流させ、カルシウムイメージングを用いて神経活性化を観察します。この手法は、嗅覚分野における重要な課題の解決に寄与します。

例えば、ヤモリの鼻腔器官には数百種類のフェロモン受容体が発現していますが、そのリガンドが同定されているものはごくわずかです。フェロモン受容体は異種発現系での発現が非常に困難です。そのため、特定のフェロモンを特定の受容体に割り当てるための効率的なin vivoアッセイを開発する必要がありました。

特定のニューロンサブポピュレーションが未知の受容体を発現し、GFPの発現によって同定可能なTACTマウスを使用することができます。また、このアッセイを用いて、本手順で示されるFairmontトランスダクションカスケードに関与するイオンチャネルや酵素を薬理学的に解析することも可能です。本日は、解剖を開始する前に、私の研究室の研究員であるJulianとFabianの2名を紹介します。

塩化カルシウムを除くすべての成分を混合し、新鮮で冷たい人工脳脊髄液（oxy carb飽和A CSF）を調製します。oxy carbを直接バブリングして溶液を飽和させます。その後、塩化カルシウムを加え、二回蒸留水で目的の量まで調整します。

A CSF溶液は使用するまで氷上で保持してください。成マウスの安楽死および断頭後、冷やして継続的に酸素および二酸化炭素を飽和させたA CSFを入れたペトリ皿を用意します。下顎を除去した後、マウスの頭部をペトリ皿に入れます。

解剖顕微鏡の下にマウスの頭部を配置し、口蓋を可視化します。次に、マイクロシザーを用いて口蓋上部に水平に切開を加え、マイクロ解剖鉗子で口蓋膜を除去します。露出した空洞をA CSFで水和させ、洗浄します。

鼻中隔の上部と下部を切断します。次に、VNOを含む鼻中隔を慎重に摘出し、そのまま清潔なA CSFに垂直に配置します。マイクロ解剖ピンセットを用いて、VNOの2つの部分を分離します。

VNOの軟骨被包を特定し、すべての軟骨片が取り除かれるように注意しながら、慎重に除去します。ここで、単離されたVNO、除去された軟骨片、および解剖前のVNOを示します。まず、3%低融点アガロースを調製し、必要な器具を揃えてワークスペースを整えます。包埋モールドにアガロースを満たし、温度が41 °C以下であることを確認してから、解剖したVNOを浸します。冠状断（コロナ切片）を得るために、組織を垂直に配置します。

埋め込み型モールドを氷上に1分間置き、アガーを凝固させます。1分後、アガーブロックを取り出し、アガーをパラメタル形状にカットし、ミクロトームのサポートに接着します。冷たいCSF中で、速度0.5 millimeters per second、振幅0.7 millimeters、厚さ100 micrometersで、VNOの冠状断面スライスをミクロトームで切断します。

ブラシを用いて組織切片を回収し、冷えたA CSFを満たした組織培養プレートに配置します。これにより、回収した組織切片の構造的完全性を確認し、固定後に細胞骨格成分やその他の目的タンパク質に対する免疫染色を行うことが可能になります。ここでは、アセチル化チューブリンに対する免疫染色（紫色）により、組織切片の構造的完全性が示されています。さらに、特定のフェロモン受容体をGFPでタグ付けした特定のニューロン集団を観察することで、保存されたニューロン形態が確認できます。暗室での観察により、小さな卵形の細胞体と、管腔の表面まで伸びて微絨毛で終わる長い樹状突起を持つニューロンが観察されます。

VNOスライスを、7 µMのURA 2:00 AMおよび0.1%onicを含む冷えたA CSFのローディング溶液中で、37 °Cで1時間インキュベートします。1時間後、ロードしたスライスを使用時まで oksy carbonation 状態で氷上に保持します。絵筆を使用して、ロードしたスライスをA CSFを含む灌流チャンバー内に配置し、組織スライスアンカーでスライスを固定します。

灌流チャンバーをカルシウムイメージング装置の顕微鏡ステージに設置し、室温の酸素飽和人工脳脊髄液（A CSF）で連続的に灌流します。染料に対応する蛍光波長（Fluo-4の場合は340〜380 nm）を用いて、染料を導入したVNOスライスを観察します。適切なソフトウェアを使用して、細胞内カルシウム比の変化を記録してください。化学刺激を誘発させるには、灌流システムが必要です。

ここでは、V1rb2フェロモン受容体を発現するニューロンのサブポピュレーションがGFPも発現しているマウスのvno組織の冠状切片において、アセチル化チューブリンタンパク質を紫色で免疫染色した様子を示しています。切片の高倍率像では、組織の完全性が維持されていることがわかります。長い樹状突起を持つニューロンが管腔の表面まで達している様子が示されており、カルシウムイメージングのための樹状突起のノブおよび微絨毛に構造タンパク質の発現が見られます。

FUをロードした組織切片をまずホフマン位相差顕微鏡で観察し、血管（1番目の白い矢印）を起点として関心領域を特定します。観察者はゆっくりと管腔（2番目の白い矢印）および神経上皮領域へと進みます。RO鼻腔ニューロンの楕円形の細胞体は、その長く細い樹状突起によって識別でき、これは3番目の白い矢印で示されています。

管腔内に伸びる4番目の白い矢印は、神経樹状突起のノブ（dendritic knob）を示しています。5番目の白い矢印は、フェロモンRAを負荷した細胞に接触している微絨毛を示しており、ここではまず380 nmで、次に340 nmおよび380 nmで順次光照射を行い、この蛍光波長比を算出することで、選択したニューロン（黒、赤、青の円）における細胞内カルシウム変化を測定します。ニューロンの生存率の判定にはATPを用います。

選択した3つのニューロン全体で示されているカルシウム応答の範囲と、赤丸で囲まれた2番目のニューロンがTPに反応しておらず、そのため以降の解析から除外される点に注目してください。次に、尿およびマウスフェロモンの混合物の両方を用いて化学刺激を行い、組織スライスの深部を確認します。GFPとV1RRB2受容体の両方を発現しているニューロンのサブポピュレーションを特定できます。

ここでは、GFPとV1RB2受容体の両方を発現しているニューロンと、V1RB2を発現していないニューロンを並べて示しています。両細胞にURA-2 AMをロードさせると、V1RB2発現ニューロンは受容体のリガンドである2-heptanoneの灌流に反応してカルシウムスパイクを示します。興味深いことに、V1RB2非発現ニューロンも2-heptanoneに反応しており、VNOにおけるフェロモンコーディングの複雑さが示されています。

このビデオを視聴することで、急性組織切片作製のために、マウスからマール細胞器官を抽出および微小解剖する方法を十分に理解できるはずです。このプロトコルは、別のカルシウム指示薬や顕微鏡セットアップを用いた生理学的研究にも適用可能です。実験の成功をお祈りします。