高秩序のナノシートにペプトイドポリマーおよびそれらの自己組織化の固相Submonomer合成

この手順の全体的な目的は、固相ペプチド合成および、ペプチドが高度に秩序化されたナノシートへと水中で自己組織化するための、簡便かつ効率的な手法を記述することです。ポリペプチドと構造的に類似したペプチドは、側鎖がα炭素ではなく窒素に結合した置換グリシンポリマーです。このプロセスは、他のサブモノマー法を用いて特定のペプチド配列を合成することから始まります。

サブモノマー法は、各モノマーを順次鎖に導入する2つの簡単な化学工程で構成されています。まず、固相担体に結合したアミンをブロモアセチル化します。次に、臭化物を一次アミンで置換します。

これらの工程を、目的の鎖長に達するまで繰り返します。鎖の伸長後、ペプチドを固相担体から切り離し、得られた粗ペプチドオイルをHPLCで精製し、特性評価を行うことで、ペプチドのナノシートへの自己組織化を開始させます。ガラスバイアル中でペプチドの希釈水性バッファー溶液を調製し、穏やかに混合します。これが最終ステップとなります。

ナノシートを顕微鏡下で観察します。その結果、2つの単純な化学ステップを反復させることで、自発的にナノシートへと自己組織化する配列特異的ポリマーを合成できることが示されました。ペプチドは、タンパク質と従来のポリマーの中間的な特性を持つ、バイオインスパイアされた新しいクラスのポリマーです。

ペプチドは、従来のポリマーのような堅牢さと合成上の汎用性を備えつつ、タンパク質やDNAのように高度な調整が可能で配列特異的であるため、生物医学や材料科学における主要な課題（生理活性薬の同定や人工タンパク質の設計など）を解決するための先端材料として注目されています。ペプチドの主な利点には、精密な配列制御、極めて多様なビルディングブロックの利用可能性、効率的な合成、およびプロテアーゼ安定性が挙げられます。ここでは、基本的な設備と市販の試薬を用いた一般的なペプチドの手動合成法を概説し、ほとんどの研究室でペプチドを容易に合成できるようにします。

合成ステップを視覚的に実演することは極めて重要であり、固相合成の分野に入る人々にとって貴重なリファレンスとなります。ここでは、両親媒性36量ペプチドの精製と特性評価、およびその高度に秩序化されたナノシートへの自己組織化について初めて解説します。まず、書面によるプロトコルに従って実験装置のセットアップを行い、本プロトコルを開始してください。

視認性を高めるため、以下の手順は使い捨てのポリプロピレン製フリットカートリッジではなく、ガラス製反応容器を用いて行います。100 mgのR amide樹脂をフリット付き反応容器にセットした後、2 mLのジメチルホルムアミド（DMF）を加えて樹脂を膨潤させ、バブリングにより10分間撹拌します。次に、真空吸引で溶液を排出し、膨潤した樹脂を単離します。

次に、Fmoc基を脱保護するため、20% full methyl pyridine in DMFを1 mL添加します。2分間撹拌し、液を排出します。この工程を12分間繰り返した後、DMF 2 mLを添加して15秒間撹拌し、液を排出することで樹脂を洗浄します。

ブロモアセチル化と置換ステップを含む最初のサブモノマーサイクルで、ペプチド鎖の伸長を開始します。ブロモアセチル化では、0.6 molarのブロモ酢酸DMF溶液1 mLとジイソプロピルカルバミド86 µLを添加します。30分間攪拌した後、液を排出し、2 mLのDMFで洗浄します。

次に、1〜2 Mのアミン1 mLを加えて置換反応を行い、エンドメチルピロゲノン中で30〜120分間インキュベートします。インキュベーション後、液を排出し、2 mLのDMFで洗浄します。同様に、サブモノマーサイクルを繰り返してペプチド鎖を伸長させます。最終的な置換が完了した後、2 mLのDMFで洗浄します。

次に、diora メタン洗浄キャップを装着し、切断操作まで反応容器を保存します。切断を開始するには、フード内で適切な個人用保護具を着用し、乾燥した樹脂をすべて 20 milliliter のシンチレーションガラスバイアルに移します。シンチレーションガラスバイアルに 4 milliliter のトリフルオロ酢酸（または TFA 切断カクテル）を加え、キャップを閉めます。室温で 10 分から 2 時間まで、強力に撹拌します。

あるいは、ロータリーシェーカーを用いて溶液を混合します。使い捨てのポリプロピレン製フリットカートリッジを用いて樹脂をろ過し、あらかじめ重量を測定した新しい20 milliliterのシンチレーションガラスバイアルにTFA開裂溶液を回収します。次に、1 milliliterの新鮮な開裂カクテルを加えて樹脂を洗浄し、残留しているペプチドをすべて回収します。

これを繰り返し、2回洗浄します。緩やかな窒素気流を吹き付けるか、Biot charge V10エバポレーターを使用してTFAを蒸発させます。その後、粗製油を1:1のアセトニトリルと水の混合液6 mLに溶解させます。

その後、サンプルを凍結させ、凍結乾燥させます。この工程を、2回目の凍結乾燥後にもう一度繰り返してください。粗生成物の重量を記録し、乾燥粉末として-20 °Cで保存します。その後、分析用HPLCおよび/またはエレクトロスプレーLCMSを用いて確認を行います。

粗生成物の純度および目的の分子量が存在するかどうかは、本文に記載された手順に従って決定できます。その後、記載された手順に従い、逆相分取HPLCを用いて粗ペプチド混合物を精製できます。本セクションでは、単鎖配列特異的な両親媒性36 meペプチドからシートを形成するためのプロトコルについて説明します。

ペプチド鎖を合成、精製し、凍結乾燥させた後、得られた白色粉末をDMSOに溶解して2 mMのストック溶液を作成します。次に、20 µMのペプチド溶液を調製するために、Dr.Glassファイルを用意します。まず、445 µLのmilli Q水と50 µLの10xシート形成バッファーを加えます。

バイアルをボルテックスして混合します。次に、2 mMのペプチドストック溶液を5 µL加え、緩やかに膨潤させます。得られた溶液シートは、希釈した水性ペプチド溶液を穏やかに攪拌することによって形成されます。

蓋をしたガラスバイアルを水平位置から垂直位置へとゆっくりと傾けます。これによりシートが緩やかに揺れ、シートが得られます。しかし、多くの高品質なシートを得る場合、この方法で得られるシートは小さくなる傾向があり、直線的なエッジも少なくなります。

チューブローテーターまたはナノシートの蛍光染色用にカスタマイズしたロッカーを用い、ガラスバイアルを水平軸を中心に1日間ゆっくりと回転させます。ナノシート溶液100 µLに100 µMのNile redを1 µL加え、最終濃度を1 µMにします。Nile redは環境感受性染料であり、疎水性環境に局在すると蛍光強度が増加します。次に、熱水で1%のアガロース溶液を作成し、プラスチック製ペトリ皿に流し込みます。

アロス溶液の厚さが約1/8インチになるようにし、平らな表面で静置して溶液を冷却させます。アロスが凝固した後、スパチュラを用いて1cm×1cmの正方形に切り分けます。次に、切り分けた正方形をガラススライド上に移動させ、シートを同一平面上に集めます。アロスの断片に1µLのシート溶液を滴下してください。

2分後、arosが緩衝液を吸収し、シートが表面に残ります。15分以内にシートをイメージングしてください。あるいは、シートと溶液をイメージングする場合、ガラススライド上の直径20 mm、厚さ0.12 mmのガスケット内に15 µLを注入します。

サンプルをカバーガラスで覆い、数日以内にイメージングを行い、ナノシートのSEM観察を実施します。まず、ナノシートの吸着を促進させるため、シリコンチップをプラズマエッチングします。次に、プラズマ処理したシリコン基板上にペプチドシート溶液を20 µL滴下し、3分間静置します。その後、キムワイプの端を用いて余分な溶液を取り除きます。さらに、表面に20 µLの水を滴下し、再び余分な溶液を吸い取って、バッファーと塩を除去します。

あるいは、バッファーと塩を除去するために、ペプチドシート溶液を水に対して透析させます。この場合、透析後のシート溶液 20 µL をプラズマ処理したシリコン基板上に滴下し、自然乾燥させることができます。シート溶液がプラズマ処理したシリコン基板上で乾燥した後、加速電圧 1 kV から 5 kV の範囲でインレンズ検出器を用いて SEM でシートを観察できます。

高度に規則正しく配列された二次元ナノシートへと折りたたまれる、配列特異的な36 me ブロック電荷ペプチドの合成、特性評価、および精製を行った。36 me ブロック電荷ペプチドの合成には、エチレンジアミン、フェネチルアミン、およびt-ブチル-β-アラニンを用いた。合成後、粗ペプチドを95%水溶液TFAを用いて樹脂から切り出した。

TFA溶液を回収し、蒸発させた後、粗製の36 me ブロック電荷ペプチドを逆相HPLCで精製した。その後、精製したブロック電荷ペプチドの質量をMALDIで確認した。

観測された質量 4981.2 は、計算上の質量 4981.74 とよく一致しています。凍結乾燥粉末を DMSO に溶解して 2 mM のストック溶液を調製し、4 °C で保存しました。上述のプロトコルに従ってシートを調製し、蛍光光学顕微鏡を用いて撮影しました。

最大300 µmまでの特徴サイズを持つ多様な形状が観察され、特に直線的なエッジが顕著に現れています。SEMを用いてシートを撮像した際にも、同様に顕著な直線的エッジが確認されました。このビデオでは、ペプチドの固相合成および、ペプチドの水系自己組織化によるナノシート形成のための、簡便かつ効率的なプロトコルについて解説します。

数百種類ものam平均の構成ブロックが容易に入手可能であり、本プロトコルで使用できるため、ポリペプチドによってアクセス可能な設計空間は実質的に無限です。ペプチドは、合成の柔軟性、堅牢性、および秩序化能を備えているため、生物医学およびナノサイエンス研究において有望な材料です。特に原子レベルにおいて、ナノシートは、二次元ディスプレイ足場、膜模倣体、バイオセンサ、タンパク質模倣体、およびデバイス作製のための潜在的なプラットフォームとして機能します。

トリオール、酢酸、ブロモ酢酸などの腐食性試薬を取り扱うことは非常に危険です。事故を防ぐため、すべての反応はドラフトチャンバー内で行い、適切な個人用保護具を着用してください。