脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

このビデオでは、Lipid B cellsを用いた精製膜タンパク質のハイスループット結晶化スクリーニングのセットアップ方法を解説します。まず、脂質と界面活性剤を混合してB cellsを調製し、そこに精製した膜タンパク質を組み込みます。その後、ナノリッターロボットを用いて結晶化スクリーニングを行い、視覚的な検査を実施します。標準的な光学顕微鏡を用いて観察することで、結晶の存在を確認できます。

タンパク質結晶が形成されたら、それを抽出して凍結し、データ収集および構造決定に利用します。この手法の主な利点は、B細胞のユニークな相挙動により、ラボにある標準的な機器やロボティクスを結晶化に利用できることです。B細胞のセットアップは非常にシンプルな手法であり、目的の膜タンパク質を界面活性剤ミセルから取り出し、脂質媒体へと配置することを可能にします。

これにより、スクリーニングを行うための全く新しい条件セットを得ることができます。この手法は非常にシンプルであり、多くの膜タンパク質で成功しているため、試さない理由はありません。B細胞ベースの結晶化における最初のステップは、B細胞を形成する脂質アンフィフィリクス混合物の調製です。

この工程にはかなりの労力を要し、最も時間がかかります。完了までに数時間かかる場合があることに注意してください。B細胞は、さまざまな脂質両親媒性の組み合わせおよび広範囲の濃度で形成されます。

推奨される開始条件については、付属の書面によるプロトコルの表1を参照してください。まず、2.8:1のモル比で35% DMPC/Chapo混合液を1 mL調製します。具体的には、チューブにDMPC 0.26 gとChapo 0.09 gを量り取ります。脱イオン水を用いて全量を1.0 mLにし、混合物をボルテックスします。

次に、混合物をウォーターバスで約40 °Cまで温め、その後、ゲル状になるまで待ちます。チューブを氷上に置きます。これにより、サンプルは再び流動的な状態に戻ります。

その後、再び数分間ボルテックスし、脂質が完全に溶解するまで、加温、冷却、ボルテックスの工程を繰り返します。サイクルを重ねるにつれて、完了後の冷却時に混合液が白濁する場合があることに注意してください。混合液は室温以上では透明なゲル状となり、氷上では粘性液体となります。細胞は長期保存のために-20 °Cで保存することが可能です。

次に、精製したタンパク質をB細胞培地に組み込みます。これは簡便な工程であり、ビデオの次のセクションで説明する結晶化と同日に行う必要があります。DMPCカプソB細胞混合物を、相が透明なゲルに変化するまで室温で解凍してください。

混合物を氷上に置いて液状化させた後、短時間ボルテックスしてB細胞相を再び均一にします。これ以降、B細胞混合物と精製タンパク質は氷上で保持してください。これによりB細胞が液相に保たれ、ピペッティングが可能になります。

次に、B細胞混合液を、精製された界面活性剤可溶化タンパク質に1:4（v/v）の比率で加えます。その後、溶液が透明で均一になるまで、ピペッティングで静かに混ぜ合わせます。気泡が生じた場合は、卓上遠心機で短時間遠心し、気泡を除去してください。

タンパク質が細胞内に完全に取り込まれるように、混合物を氷上で少なくとも30分間インキュベートします。これで、タンパク質と細胞の混合物が結晶化試験に使用可能な状態になります。結晶化試験は、mosquito結晶化ロボットを用いて実演します。

96ウェルV底プレートを氷上に置いて冷却します。溶液の粘性を最小限に抑えるため、タンパク質および細胞の混合液をプレートにピペッティングします。最終ステップまで、タンパク質および細胞の混合液を氷上で保持してください。

ここで使用するロボットには5つのプラットフォームがあります。リザーバーを含むマイクロプレートをプラットフォーム3に、ドロップを分注する結晶化用蓋をプラットフォーム5に配置します。次に、セルプレートによるタンパク質プレートを、分注位置に最も近いプラットフォーム4に配置します。

これにより、タンパク質と細胞の混合液がロボットによって最後に吸引され、直ちに分注されることが確実になります。ソフトウェアを使用してランを開始すると、ロボットはリザーバー溶液を吸引し、続いてタンパク質と細胞の混合液を吸引して、分注中の加熱や粘度上昇を防ぐため、蓋の上にドロップとして分注します。ランが完了してすぐに、mosquitoがリザーバーとタンパク質と細胞の混合液を混合するようにプログラムしないでください。

buy cell proteinプレートを装置から取り出し、氷上に置きます。装置から蓋を取り外し、液滴が逆さまになるように、リザーバー溶液が入ったプレートの上に置きます。プレートを20 °Cでインキュベートします。

結晶形成と最適化のために、他の温度で試験を行う場合があることに留意してください。より高い温度ではラメラ相が誘導され、タンパク質を層状に事前組織化できるという利点があります。4 °Cから20 °Cの範囲で温度を検討することが可能です。

4 °C以下の温度では、長期間にわたって脂質が沈殿することがあります。1日目、3日目、およびその後は毎週、標準光学顕微鏡を用いて結晶の外観と成長を評価してください。ここでは、アッセイのみの条件下で観察された針状結晶の明視野画像とUV画像を示しています。結晶からの蛍光は検出されなかったため、この画像における結果は偽陽性であることを示しています。

沈殿剤としてメチルプロパンジオールを用いた際に形成された棒状の結晶。この結晶は弱く蛍光を発しており、タンパク質結晶である可能性が示唆されましたが、X線回折による解析の結果、非タンパク質性であることが判明しました。ここでは、試験開始から約4週間後に観察された結晶を示しています。

UV光下での強い蛍光により、それがタンパク質結晶であることが確認されます。このビデオでご覧いただいた通りです。B細胞が利用可能になれば、それらを精製タンパク質と直接混合でき、ここからの結晶化の手順は、標準的な界面活性剤ベースのプロトコルとほぼ同様に進みます。

もう一つの明確な利点は、最適化のためにB細胞に特定の脂質をドープできることです。この手法は非常に汎用性が高く、かつ使い方も極めて簡単であるため、あらゆる膜タンパク質の結晶化プロジェクトで試行されるべきです。