電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

本手順の全体的な目的は、電子結晶学による膜タンパク質の構造決定に向けた、最適な2D結晶化条件を特定することです。これは、まず精製過程で適合性の高い界面活性剤を用い、天然の脂質二重層からタンパク質を可溶化させることで達成されます。手順の第2ステップでは、外来性脂質を添加し、タンパク質・脂質・界面活性剤の混合物を透析して界面活性剤を除去することで、厳密に制御された条件下で2D結晶を形成させます。

手順の第3ステップは、サンプルを急速凍結してガラス状態にすることです。手順の最終ステップは、クライオ電子顕微鏡（cryo EM）を用いてデータを収集することです。最終的に、データの計算機的な画像処理を通じて、タンパク質の最終構造が得られます。

こんにちは。私はジョージア工科大学生物学部研究室のティナ・ドレッドです。

私はジョージア工科大学化学・生物化学科のBerry研究室および生物学科のSchmidt Kray研究室に所属しています。そして、私はジョージア工科大学生物学科のIngleborg Schmidt Cry研究室のMatt Johnsonです。本日は、電子顕微鏡を用いた2Dコロイド結晶試験の評価手順についてご紹介します。

当研究室では、2D結晶化条件の同定および最適化のためにこのプロトコルを使用しています。それでは、手順を開始しましょう。まず、カーボンコートを施した400メッシュの銅製透過電子顕微鏡（TEM）グリッド上に、ネガティブ染色試料を調製します。プロテオリポソーム試料 2 µLをカーボン被覆TEMグリッドの下にピペットで滴下し、60秒間インキュベートします。

サンプルが均一に広がっていない場合は、ピペットチップの側面で静かに撫でて広げます。次に、ちぎったWhatman No.4フィルターペーパーを用いて、端から液体を吸い取り、ブロックします。これにより、プロテアリポソームを過剰に除去することなく液体を最適に除去でき、繊細なカーボンフィルムを保護することができます。

ブロッティング直後に、1%酢酸ウラニル染色は液を2 µL滴下し、30秒後にグリッドの端からブロッティングします。なお、サンプルに高濃度の粘性グリセロールまたはスクロース（通常10～20%の範囲）が含まれている場合は、陰性染色を行う前に、グリセロールまたはスクロースを含まないバッファーでグリッドを数回洗浄すると、酢酸ウラニル溶液による適切な染色が可能になります。

グリッドの準備が完了した後、電子顕微鏡を用いて低倍率でサンプルを観察し、膜の出現分布、形態、およびグリッド全体の品質を確認します。その後、高倍率を用いて画像を取得し、得られた画像にRIA変換を施して2D結晶を同定します。まず、電子顕微鏡のサンプルホルダーにグリッドをセットし、膜の平均的な分布について概観するため、2000〜10,000倍の中倍率で観察します。

膜の分布範囲、形態、およびサイズを実験ノートに記録します。代表的な視野をCCDカメラで撮影してください。次に、必要に応じて、400〜800倍程度の低倍率でサンプルを観察し、グリッドの全体像を確認します。

これにより、試料濃度、タンパク質やリポソーム分布の不均一性、およびカーボンフィルムの部分的な破損といった問題を明らかにすることができ、グリッド作製を評価するための貴重な情報が得られます。低倍率または中倍率で、目的のグリッド領域を特定してください。その後、高倍率を用いて、異なる膜における秩序の有無を評価します。

これは2D結晶化試験の初期段階において極めて重要です。秩序だった領域を持つ有望なタンパク質リポソームを特定し、その後の実験での再現性を検証するため、2D結晶スクリーニングに最適な高倍率設定を決定するには、まず50,000から60,000 xの倍率から開始してください。2D結晶の寸法および単位格子のサイズに応じて、高倍率設定を30,000まで下げるか、あるいは80,000まで上げることがあります。

関心領域に隣接する場所において、関心領域が本当に膜であるか不確実な場合は、約−400 nmまたはそれ以上にデフォーカスします。サンプルに、プロテオリポソームと見間違えそうなカーボンフィルムの破片やMICA、その他のアーティファクトがないかを確認してください。また、端部分を観察し、典型的な膜の折りたたみや形態を確認します。

次に、CCDカメラで関心領域を観察します。最適な高倍率設定でCCD画像を収集しても、小さい、または大部分が疎水性である膜タンパク質の格子は、CCD画像自体の視覚的な評価では観察できない場合があります。この場合、画像全体を用いてオンラインでのフーリエ変換（FT）を行います。

ただし、秩序配列が小さい場合、このFT（フーリエ変換）にはかなりのノイズが含まれることになります。S/N比を向上させるには、ボックス画像のサイズを小さくし、縮小したボックスを画像上で移動させながらライブFTを実行してください。また、秩序配列を最適に識別するために、ライブFTのガンマ関数を調整します。ガンマ値が高すぎるとノイズの影響でスポットが隠れてしまい、逆に低すぎると弱いスポットが識別できなくなります。ネガティブ染色した2D結晶の分解能は、DFO（暗視野焦点）が-400 nmのときにおよそ15 Åになると予想されます。

1〜3次までスポットが確認されることが予想されます。スポットの鋭さおよびモザイクの有無に注意してください。18 kilodaltonの小さな膜タンパク質の2次元結晶は、サイズが最大で数ミクロンに達します。

FTS上のスポットが鮮明であり、ライブFTボックスの移動が容易に識別できることは、格子がモザイクなく連続していることを示しています。より広範な可溶性ドメインを持つ大きなタンパク質の格子は、T-E-M-C-C-D画像収集の小さな画面上で識別可能ですが、無秩序なタンパク質のFTにおけるモザイクノイズなどの特性を含め、格子品質をより正確に評価するにはFTが必要です。リポソームが弱いスポットと誤認される可能性があるため、スポットが小さなタンパク質の2D結晶によるものか、あるいはノイズによるものかを判断する必要があります。

ライブFT（Fourier transform）用のボックスを移動させます。スポットがすぐに消える場合はノイズですが、たとえ狭い範囲であっても変化せずに残る場合は、脂質結晶が特有の形態とFTを示すため、結晶が存在している可能性が高くなります。これらの脂質結晶は、画像の目視検査および一定の単位格子サイズによっても識別可能です。

初期の試行において沈殿が生じることがあります。タンパク質の沈殿と脂質凝集体を区別するために、高倍率での観察を行います。脂質凝集体であった場合は、実際には再構成が起こっていた可能性があり、以降の実験では、再構成を誘導することよりも、膜サイズを大きくし、秩序を形成させるために必要なパラメータの調整のみが必要となります（30,000から50,000 ×g）。

これらの暗い構造の端から、それらがタンパク質を含まない膜で構成されていることが分かります。最適な条件下での沈殿サンプルには、高比率で2D結晶が含まれます。データ収集には、最大で最も秩序だった2D結晶を視覚的に選択するため、膜の見た目を均一にする必要はありません。

これらの種類の試料は、結晶化が容易に認識でき、クライオ電子顕微鏡（cryo EM）によるデータ収集に使用することで、最大限の高解像度画像を得ることができます。ここでは、この手順において、透過電子顕微鏡（TEM）を用いて小型膜タンパク質の2次元結晶をスクリーニングする方法を説明します。ここまでの段階で多大な時間と労力を費やしているため、有望な結晶化条件を見逃さないよう、徹底的に確認することが重要です。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。