脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

膜構造・機能生物学グループへようこそ。私はマーティン・キャフェリーです。私たちの研究の焦点は生物学的膜にあります。最初のスライドに概略図を示していますが、細胞や、存在する場合には細胞内オルガネラを囲むこの膜は、わずか2分子の脂質が並び、タンパク質が点在する分子レベルで薄い構造をしています。

私たちは、脂質とタンパク質の両方に適用される構造と機能に関心を持っています。しかし、このJOシリーズでは、膜タンパク質に焦点を絞ります。私たちが、これらの膜タンパク質が分子レベルでどのように機能するかを理解しようとする理由は2つあります。

第一に、何かがどのように機能するかを知ることは、知的な満足感をもたらします。第二に、自転車や自動車と同様に、その仕組みを知っていれば、故障した際に修理できる可能性があります。創薬は、このような研究から得られる明白な成果の一つです。

膜タンパク質が分子レベルでどのように機能するかを解明するために、我々は結晶構造を決定するというアプローチをとります。これには、タンパク質を構成するすべての原子、または少なくとも水素以外のすべての原子の三次元空間における位置を特定することが含まれます。この目的のために我々が使用する方法は、高分子X線結晶構造解析（略称 MX）と呼ばれます。

ここでは、MXを用いて構造が決定された膜タンパク質の例を示します。MXを行うには、高品質なタンパク質結晶が少量必要となります。図に示されているように、高分子結晶構造解析を用いた構造決定には、想像通り多くの工程が含まれます。通常これには、標的となる膜タンパク質の特定、それに続く作製、精製、および結晶化が含まれます。

自前またはシンクロトロン放射光X線源を用いて、結晶の回折測定を行います。得られた回折データを処理して電子密度マップを作成し、そこに分子モデルを当てはめます。精密化したモデルを用いることで、タンパク質の作用機序の解明や、構造ベースの創薬設計への活用が可能になります。

このJoVE記事の目的は、いわゆるin meso法による脂質メソ相を用いて、膜タンパク質の高品質な結晶を調製する方法を実演することです。この手法とその適用範囲に関する最新のレビューは、参考文献1で確認できます。ここで実施するステップバイステップのプロトコルは参考文献2に記載されており、in meso膜タンパク質結晶化試験のセットアップに必要な手順と時間をまとめたフローチャートをここに示します。

このビデオでは、赤色の破線で囲まれたステップについて解説します。マニュアルモードでのメゾ結晶化において行うべき項目がここに示されています。これには、ホストメゾを作成するための精製膜タンパク質脂質の濃縮溶液が含まれ、通常、脂質をより明確にするためにモノオレイルが使用されます。

このビデオでは、赤色染料沈殿溶液、精製水パイペット装置、ディスポーザブルチップ、および取り外し可能な針を備えたものを含む各種のハミルトン社製ガスタイトシリンジ、タンパク質溶液と脂質を混合してミセルを生成するためのナロウボアカプラーを使用します。また、ハミルトン社製のリピーティングディスペンサー、ガラス製顕微鏡スライドおよびカバーガラス、ウェル作成用に理想的なシリコン化穿孔両面スペーサーテープ、ピンセット、砕氷、ティッシュ、計算機、そして最も重要なラボノートを用意してください。

以下の手順で、ガラスサンドイッチ結晶化プレートを調製します。まず、シリライズ処理を施した顕微鏡スライドガラスをベンチ上に置きます。次に、穴あき両面スペーサーテープの片面の保護紙を剥がします。

テープの粘着面をスライドの表面に接触させ、圧力をかけます。テープをスライドに密着させます。ブレイヤーまたはローラーを使用します。ウェルの底部を保護するために、テープとローラーの間にアルミ箔を挟んでも構いません。

テープから2枚目のペーパーカバーを剥がし、上部の粘着面を露出させます。この手順により、サンプルのロードおよびその後のシーリングが可能なガラスプレートが準備されます。ロードが完了したら、ウェルを迅速かつ効率的にシーリングできるよう、個別のシリコナイズドカバースリップをプレートのすぐ近くに配置してください。

脂質を45°Cに制御された温度ブロックに3分間置き、融解させます。ここで使用する脂質は、通常、モノランド（mono land）です。本ビデオでは、脂質の融解を目視で確認できるように、赤色の染料を添加しています。

脂質とタンパク質の混合ステップに使用するため、100 µLのガスタイトHamiltonシリンジを2本準備します。タンパク質溶液を入れる方のシリンジからは、テフロンオイルを除去してください。その隣に、脂質を入れるためのシリンジを配置します。この方のシリンジについては、オイルはそのままにしておきます。

ナローボアカプラーを2本のシリンジの間に配置し、カプラーを脂質シリンジのフィンガーに接続します。カプラーをシリンジに締め付けますが、締めすぎないようにしてください。脂質シリンジのバレルからプランジャーを取り出します。

脂質が溶融していることを確認します。ピペットを30 µLに設定し、溶融した脂質のキャップ部分から30 µLをゆっくりと吸い取ります。脂質のバイアルです。

脂質は窒素またはアルゴン雰囲気下、-80 °Cで保存してください。溶融した脂質を、シリンジの開放端から可能な限りゆっくりと注入します。この際、気泡が入らないように注意してください。

プランジャーを、溶融した脂質に接するようにバレルに入れ、シリンジを垂直に保持したまま、ゆっくりとプランジャーをバレル上方に進めます。図に示すように、不注意に入り込んだ気泡はこの過程で上昇し、放出されます。これでバレル内に溶融脂質のプラグが形成されました。この体積を正確に測定する必要があります。

これはシリンジバレル上の目盛りを読み取ることで行えます。この例では、体積は23 µLであり、これを実験ノートに記録します。カプラーから伸びている針にファーをスライドさせて装着します。

プランジャーを使用して、溶融した脂質をバレルから押し上げ、カプラーの中心にある針へとゆっくりと慎重に注入します。針にわずかに充填されすぎた場合、針の先端から脂質が押し出されるのが見えます。プランジャーをわずかに戻すことで、余分な脂質をカプラー内に引き戻し、カプラー針の先端とちょうど面した状態にすることができます。

このケースでは、シリンジカプラーユニットに完全に充填されており、タンパク質シリンジと結合させる準備ができています。大きな凝集物を除去するため、溶液を 14,000 G で 10 分間、4 °C で 5 〜 10 分間遠心分離します。結晶化試験をセットアップする前に、タンパク質溶液をアイスバケットから取り出し、室温で平衡化させてください。

20 °Cにおいて、完全水和またはそれに近い状態で立方相を形成するために使用するタンパク質溶液の量を算出します。相図に示されている通り、水による完全水和は重量比で約40%の水で起こります。脂質シリンジには、密度0.94 mg/µLのmonoを23 µL充填していることを思い出してください。

これは脂質21.6 mgに相当します。したがって、21.6 × 4 ÷ 6 = 14.4 mg、すなわち14.4 µLのタンパク質溶液が必要です。25 µLまたは50 µLのハミルトンシリンジを用いて、必要な量のタンパク質溶液を吸い込み、溶液をシリンジのバレル内にあるプランジャーのテフロンチップ上に転移させます。気泡が入らないように注意しながら、ゆっくりと針を引き抜き、シリンジ内のタンパク質溶液の量を測定します。この値は、前のステップで分注された値と一致する必要があります。

脂質充填シリンジと結合させる準備として、タンパク質溶液をシリンジの筒に沿って慎重に押し上げ、開放端と面合わせにします。これは、シリンジの筒の末端から覗き込むことで確認できます。

リピンタンパク質溶液を充填したシリンジの準備が整ったので、これらを結合させます。そのためには、タンパク質溶液が入ったシリンジを、脂質シリンジに取り付けられたカプラーの開放端にねじ込みます。カプラーを介して2本のシリンジを結合させることで、一方のシリンジ内の脂質からカプラーを通り、もう一方のシリンジ内のタンパク質溶液まで、液体が連続した状態で存在することになります。

混合の準備として、組み立てたユニットを保持し、右手に1本、左手に1本のシリンジを持ちます。指と親指を用いて、カプラーを通じて両方のバレルにトルクをかけ、締め付け時にカプラーの溝に対するシールが損なわれないようにします。この段階で混合装置の組み立てに不備がある場合、ALSを損傷させて漏れの原因となるほか、締め付けすぎによる漏れにつながる可能性があります。

不可避な試行錯誤や時折起こるサンプルの損失を伴うため、習熟が必要です。したがって、貴重なタンパク質溶液を使用する前に、脂質と水または緩衝液を用いてシステムの操作感を確認しておくことが有用です。混合を行うには、組み立てた混合ユニットのタンパク質側のプランジャーを親指または人差し指で限界まで押し進め、タンパク質溶液をタンパク質用シリンジからカプラー経由で脂質用シリンジへと押し出します。ユニットが適切に密閉されていれば、この操作によって脂質側のプランジャーが同量かつ反対方向に移動します。

脂質側のプランジャーを使用して、脂質シリンジの内容物をフィルター経由でタンパク質シリンジへ押し戻します。この操作を何度も繰り返します。均一な混合相を形成させるために、100回以上のパスが必要になることもあります。

混合の開始時には、カプラーを介した試料の往復移動が不均一になることがあり、混合を促すために追加の力が必要な場合があります。これは想定内の現象です。また、初期の混合に伴い、試料に不均一な白濁が生じることがありますが、これも同様に想定内です。

ホモジナイズが進むにつれて、プランジャーを往復させる際に必要な力として感知されるテクスチャーは、より均一になり、粘性のある立方相に特有のものになります。また、出現する立方相の外観も同様に変化します。条件が適切で立方相が形成された場合、シリンジバレル内の分散液は光学的に透明に見えるはずです。

したがって、シリンジバレル内のメソ相を通して、バレルの目盛りがはっきりと読み取れるはずです。有色タンパク質の場合、メソ相はタンパク質の色を呈しますが、光学的に透明になります。シリンジミキサーを短時間氷上に置くことで、混合中にサンプルをわずかに冷却させると、均質化と透明度の達成を促進させることができます。

ただし、サンプルを過剰に撹拌しないことが重要です。激しすぎる撹拌は摩擦熱によってサンプル温度を上昇させる可能性があるため、注意してください。この時点でキュビック相が形成され、タンパク質が脂質二重層に再構成されます。これで、キュビック相を結晶化プレートの各ウェルに分注する準備が整いました。

まず、メソ相をリピーティングディスペンサーに取り付けた10 µLのハミルトンシリンジに移す必要があります。シリンジをディスペンサーに結合させて、この操作を開始してください。立方相のメソ相をシリンジに充填します。

シリンジから針とプランジャーを取り除きます。テフロン箔はそのままにしておきます。小さなコインを使用して、ディスペンサーから固定ナットを取り外します。

ラチェットアームを完全に引き出した状態で、プランジャーと針を取り外したシリンジをディスペンサーの保持リングに挿入します。リテイニングナットをガスケット側をシリンジに向けて装着し、シリンジの開放端にしっかりとねじ込みます。

シリンジが保持リングの中央に正しく配置され、バレルがラチェットアームと平行に整列していることを確認してください。これら2つの条件は、プランジャーがスムーズに動作せず、充填中にソースシリンジ内に圧力が蓄積して漏れが発生する可能性があるため、非常に重要です。プランジャーを、ナットを数回転緩めた状態でグリップリングに通し、プランジャーをシリンジの開口部に誘導してください。

ラチェットアームを完全に押し下げてプランジャーをバレル内に移動させ、プランジャーがバレル内をスムーズに、かつ最後まで移動することを確認します。ネジやガイドバーが緩んでいた場合は、締め直してから、プランジャーがスムーズに動作することを再確認してください。これで分注用シリンジに充填する準備が整いました。

組み立てたミキシングユニットの片側のプランジャーを0 µLの目盛りまで移動させます。メソ相をもう一方のシリンジおよびカプラーに転送するため、ULを装着したまま空のシリンジをミキシングユニットから取り外し、直ちに充填済みシリンジを、10 µL分注シリンジのネジ付き終端に装着されたカプラーに接続します。

カップリングの締め付け具合は非常に重要です。前述の通り、100 µLシリンジのプランジャーを押し下げて分注シリンジに充填し、メソ相をカプラー経由で転送させます。カップリングがしっかりと締め付けられており、分注シリンジのプランジャーがスムーズに動作する場合、分注シリンジに液体が充填されるにつれて、プランジャーは充填用プランジャーの移動方向と同じ方向に動き始めます。

カプラーが装着された充填用シリンジを分注用シリンジから取り外します。分注用シリンジのスチール端に短く平端のニードルを固定し、慎重に締め付けて固定します。グリップリングの結び目を締めて、プランジャーをラチェットアームに固定します。

結び目を締めすぎないよう注意してください。締めすぎるとプランジャーに傷がついたり変形したりして、使用できなくなる可能性があります。クランプ状態でのラチェットアームの可動範囲は、1 inch以内に制限することが重要です。

前述の通り、プランジャーが屈曲しやすく、送液に失敗する可能性があります。ラチェットドラムを数回押し下げてプランジャーをバレル内で前進させ、これにより針の空隙容量を満たして針に充填します。針先からメサ相（mesa phase）の連続したストリングが現れるまで、この操作を最大10回繰り返します。

これで、結晶化試験のセットアップに使用するニードルの準備が整いました。セットアップは直ちに開始してください。結晶化試験を行う前に、タンパク質を充填したキュービックフェーズを長時間保持することは推奨されません。一部のタンパク質は、沈殿剤を添加しないキュービックフェーズ内では不安定であるため、充填しやすくするために、マルチウェル結晶化プレートとカバーガラスを、ベンチから数インチ高くした台の上に置いてください。

表面がわずかに暗いときに、最適なコントラストと視認性が得られます。沈殿剤溶液を均質化し、バイアルのキャップを取り外します。ディスペンシングシリンジを片手で垂直に持ち、沈殿剤の分注量を1 µLに設定します。もう一方の手で、ニードルの先端をウェルの底のちょうど中央に配置します。

1番目。リピーティングディスペンサーのボタンを押し、ガラス表面に200 nanolitersのmeaseを分注します。

標準的なリピティングディスペンサーを10 µLシリンジで使用する場合、針先はウェルの底から数百 µm以内に配置してください。これにより適切な分注が行われ、再現性のある分注を容易に達成できます。これには多少の慣れが必要です。隣接する4つのウェルにmeaseを充填した後、各measeボラスの上に1 µLの沈殿剤溶液を滴下します。

2 µLあたりのピペットと標準的な使い捨てチップを用い、できるだけ迅速に、充填したウェルの中央にカバーガラスを正方形に配置して均一に覆い、水密シールを形成します。スパチュラを使用して、スペーサーテープの露出した粘着面に接触しているカバーガラス部分に圧力をかけます。この酵素および沈殿剤の分注プロセスを、プレート上のすべてのウェルに充填し、封印するまで繰り返します。

これでプレートの点検およびインキュベーションの準備が整いました。追跡のために、プレートに明確にラベルを貼ってください。光感受性タンパク質を扱う場合は、通常、プレートをアルミホイルで包んでからインキュベーションチャンバーに入れます。

これらを取り出し、減光下または適切な色光の下で顕微鏡を用いて観察します。プレートを、通常20 °C前後の温度制御チャンバーに定期的なスケジュールで配置してください。偏光顕微鏡を用い、10倍または20倍の対物レンズで壁面の結晶成長を検査します。

目的として、著者の研究室で使用されているスケジュールは、セット後0、1、2、3、5、7、14、21、30日目です。マウスのボラスを慎重に検査してください。厚さ140 micronの試料内で焦点深度を調整します。

観察は、通常光および直交ニコル（直交偏光）の両方で行ってください。立方相で成長した無色の膜タンパク質結晶を通常光で観察すると、このようになります。偏光下で観察したメゾ相での無色の膜タンパク質結晶は、このようになります。また、通常光で観察したメゾ相での自然色を持つ膜タンパク質結晶は、このようになります。

構造決定の全工程における次のステップは、結晶の回収とクライオ冷却、およびそれらを用いたX線回折データの記録と処理です。これらのトピックについては、本シリーズの別のJoVE記事で解説しています。