光音響流量測定法を用いて循環メラノーマ細胞の検出と分離

本実験の目的は、二次腫瘍が形成される前に癌の存在を検出することです。これはまず、ステージ4のメラノーマ患者から血液サンプルを採取し、分離することで達成されます。次に、その血液を光音響フローチャンバーに導入することで、メラノーマ細胞の検出と単離を行います。

次に、捕集した細胞をイメージングし、検出されたメラノーマの存在を確認します。結果は、光音響波形と細胞イメージング技術に基づき、メラノーマ細胞を正確かつ迅速に検出・単離できる本システムの能力を示しています。RT-PCRやバイオーム磁気細胞分取法（Magnetic Cell Sorting）などの、血中メラノーマ細胞を検出する既存の手法に対する本手法の主な利点は、ラベルフリーであり、細胞表面を改変したり基質に固定したりすることなく、血中メラノーマ細胞を捕集できる点にあります。

転移性がん検出のためのサンプルを調製するには、まずステージ4のがん患者から全血を約10 milliliters採取します。2本の5 milliliter vacutainer centrifugeチューブに入れ、3000 RPMで10分間遠心分離します。これにより、血液サンプルは3つの異なる層に分離します。最下層は赤血球で構成されています。

バフィーコートとも呼ばれる中間層には白血球とメラノーマ細胞が含まれ、上層には血漿と血小板が含まれます。バフィーコートを乱さないように、可能な限り血漿を取り除きます。2 mLのマイクロチューブに250 µLのhis opaque 10 77を加えます。

9インチのパステルピペットを用いて、残りの血漿、バフィーコート全体、および赤血球の上層を抽出します。採取量が500 µL未満になるように注意してください。抽出した溶液を、あらかじめ準備しておいたwind Trobeチューブに移します。

血液は再び分離しますが、今回はヒスパによって赤血球が分離されるため、バフィーコートを容易に抽出できます。9インチのペサピペットを使用してバフィーコート全体を分離し、2 mLのエンドルフチューブに入れます。その後、2% v/vのβ2-ミクログロブリンを含むPBS 1.5 mLに懸濁させます。

フローチャンバーを製作するには、まず、長さ 8 mm、外径 20 mm、内径 17 mmのアクリル製シリンダーを用意します。次に、シリンダーの側面に、互いに 90 度の角度になるよう、直径 5 mmの穴を3箇所開けます。その後、ポリマーチューブを3本カットし、開けた穴に挿入します。

アクリルリングの底部にパラフィルムを伸ばして貼り、水密シールを作成します。パラフィルムがアクリルリングと共に浅いボウルの形状となり、フローチャンバーを形成するためのアクリルアミド溶液を保持します。互いに正反対に位置するチューブの断片を通して直径1.6 millimeterのワイヤーを渡し、リングの中央から3本目のチューブに向かってワイヤーのみが見えていることを確認してください。

直径1.6 millimeterのワイヤーを挿入し、チューブを吊り下げたワイヤーから1 millimeter離れた位置に配置します。これらのワイヤーにより、アクリルアミドがチューブ内に流入するのを防ぎます。アクリルアミドを5 milliliters調製します。

次に、混合液をアクリルリングに素早く注ぎ、上端まで満たします。数秒後、溶液がゲル化します。フローチャンバーの型を作成するため、アクリルアミドゲルの形状を乱さないように注意しながらワイヤーを慎重に引き抜きます。これにより、円筒形の流路と、流路に焦点を合わせた光ファイバーを配置するためのスペースが形成されます。

フローチャンバーの超音波ゲルの音響的な準備が整いました。ポリフッ化ビニリデン（PVDF）圧電音響トランスデューサを、流路の直上のフローチャンバーに結合させます。バヨネットコネクタまたはBNCケーブルを使用して、トランスデューサを広帯域レシーバーの入力端子に接続します。

フィルターの出力をオシロスコープに接続し、オシロスコープをトリガーさせます。トランスデューサーの近くにフォトダイオードを設置し、BNCケーブルを使用してオシロスコープに接続します。フローチャンバーの小さなチューブを引き出し、小さな空気溜まりができるまで調整した後、トランスデューサーと結合させます。

次に、光ファイバーを挿入し、界面信号を低減して流路に照射されるレーザー光量を増やすために、ポケットを水で満たします。光ファイバーの開口数と流路までの距離が短いため、レーザーは常に1つのサンプルスラグのみを照射し、レーザーの直前にあるサンプルが光音響信号を生成しているサンプルと同じであることを保証します。

次に、フローチャンバーの一方のアームにTコネクタを取り付け、コネクタの他の分岐に2台のシリンジポンプを接続します。一方のシリンジには空気、もう一方には事前に調製した細胞懸濁液を封入します。その後、両方のシリンジポンプを作動させます。

2つの許容流体がT字接合部に到達すると、均質なスラグ状に分割され、トランスデューサを通過します。流れているサンプルにナノ秒パルスレーザーを照射し、メラノーマ細胞内に光音響波を発生させます。メラニンは広帯域の光吸収体であるため、可視光領域の任意のレーザー波長を使用できます。

ナメクジがトランスデューサーの上にあるときにオシロスコープに信号が表示されれば、そのナメクジにメラノーマが含まれていることを示します。回収バイアルに投入する前に、システム内で追跡してください。免疫細胞化学用のサンプルを調製するには、ガラススライドをサイトファネルに入れ、サイトスピンにセットして遠心分離を行い、捕捉した細胞をガラススライドに密着させます。

各ファンネルに1%BSA含有PBSを100 µLずつ加えます。その後、600 RPMで3分間遠心分離します。遠心分離後、CyTOFファンネル用に細胞サンプルを加え、再び600 RPMで3分間遠心分離します。

スライドにエタノールベースの固定液をスプレーします。次に、非特異的な結合をブロックするため、PBSで10分間の洗浄を2回行います。各スライドを、10 µLのヤギ血清と90 µLのPBSの混合液とともに、室温で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、スライドの液を捨て、一次抗体溶液を加えます。各スライドに1% rabbit mark、1% mouse CD 45、およびPBSに含まれる10% goat serumを加え、加湿チャンバー内にて室温で1時間インキュベートします。次に、PBSでスライドを10分間、3回洗浄します。

次に、スライドを適切な蛍光二次抗体とともに暗所で室温にて1時間インキュベートし、液を捨てます。その後、PBSで5分間の洗浄を3回行い、核を染色します。続いて、0.1 µg/mLのDPIを用いて細胞を1分間インキュベートします。最後に、スライドの液を捨て、PBSで洗浄します。

最後に、樹脂ベースのマウント剤を用いて細胞サンプルの上にカバーガラスを被せ、カバーガラスを透明なマニキュアで密封し、蛍光顕微鏡で撮影します。白血球およびメラノーマ細胞からの光音響波形をここに左側に示します。固有の色素を持たない白血球は光音響波を発生させないため、右側に示すように電子ノイズのフラットラインとして現れます。

しかし、色素を持つメラノーマ細胞は強力な光音響波を発生させます。免疫細胞化学染色および化学染色後、培養されたメラノーマ細胞は青色の斑点状の信号を示しており、そのうちの1つがDPIのオーバーレイ画像で緑色に強調され、もう1つが白血球の指標としてCD 45でマークされています。この図は、分化後のメラノーマ細胞が複数の白血球の中に存在している様子を示しています。

本手法は、がん検出分野の研究者が転移現象を追求し、がん検出の向上および最終的にはその致命的な転移を治療するための道を切り拓くものです。