区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

本手順の全体的な目的は、区画化されたマイクロ流体デバイスを用いて、がん細胞の遊走を視覚的に観察し、その特性を明らかにすることです。まず、無血清培地で培養した脳腫瘍幹細胞の既存のニューロスフィアを分散させます。次に、二層構造のSU-8マスターを作製し、ソフトリソグラフィーを用いて、区画化設計がなされたPDMSスタンプを成形します。

次に、マイクロ流体デバイスを組み立て、脳腫瘍幹細胞をロードします。最後に、オールインワン顕微鏡システムを用いて、脳腫瘍幹細胞の遊走に関する長期タイムラプスイメージングを行います。最終的に、脳腫瘍幹細胞が極めて狭い空間を遊走する際、形態学的段階が周期的に繰り返されることが結果から示されます。

Transwell Boyton Chamberのような既存の装置と比較して、この手法の大きな利点は、マイクロデバイスを用いることで、遊走プロセスの視覚的な観察、細胞の制御された配置、および因子の精密な送達が可能になることです。したがって、マイクロ流体技術は、信頼性が高く、効率的で、費用対効果の高い単一細胞の選択およびナビゲーションという特長を備えています。高度な遊走能を持つ細胞の単一細胞解析によって、将来的な化学療法の標的となり得る候補を特定できる可能性があるため、この手法の意義はがんの転移および再発の治療にまで及びます。

この手法はがん系の遊走挙動に関する知見を提供しますが、胚発生、免疫応答、創傷治癒、器官再生などの他の系にも適用可能です。BTSC由来の神経球の細胞懸濁液を用意します。細胞を15 mLのコニカルチューブにまとめ、900 RPMで5分間遠心分離します。これ以上の速度で回転させないでください。

上清を吸引します。次に、37°Cで予熱した0.5 mLのAccutane中で5〜10分間インキュベートし、ニューロスフェアを緩めます。インキュベーション後、P100ピペットを用いて10〜20回ゆっくりとピペッティングし、細胞を機械的に分散させます。

次に、幹細胞培地1.5 mLを加えてAccutaneを中和し、細胞懸濁液を1300 RPMで5分間遠心分離した後、1 mLの幹細胞培地で細胞を再懸濁させます。血球計数計を用いて細胞密度を確認し、密度を20,000 cells/µLに調整します。SU-8マスターの作製を開始するために、Adobe IllustratorとImage Setterを組み合わせて、レーザープリンター用透明フィルムを用いて2枚のフォトマスクを準備します。

第1層のフォトマスクは、2つの基準マークとマイクロチャネルのアレイで構成されており、第2層のフォトマスクには設置および受容チャンバーがあります。両方のマスク層をイソプロパノールで洗浄し、自然乾燥させます。次に、ハンドルウェハーに厚さ3 µmのSU-8フォトレジストをスピンコートし、続いてソフトベークを行います。

次に、第1層目のフォトマスクを密着させ、UV露光を行い、フォトレジストを硬化させます。その後、硬化したウェハーをポストベイクし、現像します。ハンドルウェハーのフィデューシャルマーク領域をスコッチテープで覆います。

次に、ウェハーに厚さ250 micronのフォトレジストをスピンコートします。その後、テープを剥がしてアライメント用のマーカーを露出させます。2層目のフォトレジストを塗布し、基準マーク（フィデューシャルマーク）に合わせて位置調整を行います。

次に、2層目のフォトマスクにUV露光およびキュアを行い、続いてポストベークと現像を行います。表面の粘着性を軽減するため、蒸着によりSU-8マスターの表面処理を行います。ウェハーをデシケーターに入れ、真空状態でトリクロロエチレン溶液を数滴滴下し、少なくとも1時間保持します。

これで、マスターを用いてPDMSを成形する準備が整いました。まず、前ポリマーベースと硬化剤を10:1の比率で十分に混合します。次に、気泡が見えなくなるまで、混合物をデシケーターに入れて真空脱泡します。

混合液をマスク上に注ぎ、再度脱気します。新しい気泡が生じた場合は、90 °Cに設定した水平なホットプレート上で2時間、モールドを硬化させます。室温まで冷却した後、PDMSスタンプを慎重に剥離させます。

これで、PDMSに培養チャネルが刻印され、マイクロ流体デバイスを組み立てる準備が整いました。マスターは、ひび割れたり摩耗したりするまで、成形に繰り返し使用できます。マスターに粘着性が生じた場合は、離型コーティングを再度塗布してください。

まず、PDMSスタンプを用いてマイクロ流体デバイスにinletおよびoutletを作成します。生検用パンチ（biopsy hole puncture）を使用し、PDMSスタンプを70% ethanolに30分間浸漬して洗浄した後、脱イオン水で10分間すすぎます。オートクレーブ処理を行い、PDMSスタンプの滅菌および架橋反応を完結させます。

次に、ポリLリジンでコーティングしたガラスカバースリップ上にPDMSスタンプを配置します。その後、リザーバー入口からラミネート溶液をチャンバーに注入してデバイスをコーティングし、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、デバイス内からラミネートを吸引して除去します。

次に、ステムセル培地を2回満たしてデバイスを洗浄します。ここで、11 µLの解離細胞を播種リザーバーの1つにロードします。必要に応じて、真空吸引を用いて細胞をチャンバー内に強制的に導入してください。その後、さらに7 µLの細胞を隣接する播種リザーバーにロードします。

5分後、シーティングおよびレシービングリザーバーに培地が満たされます。ここで、厚さ0.5〜1 mmの滅菌済みPDMSシートをデバイス上に配置します。PDMS自体の自然な表面密着性によりデバイスが密封されます。密封後、輸送、インキュベーション、および顕微鏡イメージングが可能な状態になります。

biot, IMを45分間作動させ、あらかじめ平衡化しておきます。温度、湿度、および空気供給を安定させるため、サンプルチャンバーに数皿の水を追加し、適切な湿度を確保します。準備したデバイスを顕微鏡のサンプルチャンバーにロードします。

マイクロピンセットを使用してデバイスを中央に配置します。次に、Biotソフトウェアを用いてフォーカス位置とタイムポイントを設定し、必要に応じてタイムラプス記録を開始します。培養から5日後に、培養液を交換します。

デバイス内に播種されたBTCは、位相差顕微鏡により連続的に記録されました。セッティングチャンバー内において、紡錘形の細胞は5日間にわたり前遊走段階に留まりました。細胞がマイクロチャネルの入口に近づくと、一部の細胞が伸展し、接着性の突起を形成しました。

1つの細胞だけが入口を占有し、遊走方向を探索することができました。細胞が遊走方向を決定すると、一定の高速度でマイクロチャネル全体を巡航しました。マイクロチャネルの末端において、細胞は回収チャンバーの開放空間を探索し、最終的にそこへ進入しました。

2回目のイメージング間隔で細胞を観察したところ、遊走能は主にOID細胞に見られるようなブラビング（blabbing）活性によって生成されていることが分かりました。本手順を実施する際は、デバイスの設計に柔軟性があるため、目的の細胞遊走度を実現するためにマイクロチャネルの寸法を調整できることを念頭に置くことが重要です。このビデオを視聴することで、目的の細胞の培養に適した独自の区画化マイクロ流体デバイスを作成し、本手順に従って長期タイムラプスイメージングを行うことで、これらの細胞の遊走特性を定性的および定量的に定義する方法について十分に理解できるはずです。

高度に遊走能を持つがん細胞が遺伝的にどの程度異なっているかといった追加の疑問に答えるために、次世代シーケンシングやDNAマイクロアレイなどの他の手法を適用することができます。