単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

本実験の全体的な目的は、細菌に付着性を付与し、液体培地からの分離を容易にすることです。まず、複雑な遺伝子調節を回避し、粘着性ポリマーを容易かつ大量に産生できるように、合成curliを設計します。次に、ポリスチレン上での付着細菌を可視化および定量し、これにより合成デバイスの効率を迅速に推定します。

次に、共焦点顕微鏡を用いて、ガラス上に付着した細菌を可視化します。バイオフィルムを直接観察し、その構造に関する情報を得るために、付着率の測定と顕微鏡観察の両方に基づき、合成デバイスを保持する株において付着性が有意に向上した結果が得られます。従来のクローニングなどの既存の手法に対する合成生物学的アプローチの主な利点は、適切なシグナルを持つ、絶対的に必要な遺伝子のみを保持する構築物を非常に迅速に得られることです。

この手法は、放射性廃棄物から金属負荷細菌を除去するという課題への対応など、バイオレメディエーション分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、遺伝子制御シグナルに関する基礎知識やデータベースの取り扱い能力が求められるため、この手法に不慣れな方は困難を感じる可能性があります。バイオフィルムは非常に脆弱であるため、その定量化と可視化の2つのステップを習得することが非常に困難であることから、視覚的なデモンストレーションではこれらに重点を置きます。

合成カロンを設計するための第一歩は、curly遺伝子の遺伝的構成を決定し、それらの内因的な転写および翻訳シグナルを特定することです。これは、REON DBやeco geneなどの専門的なデータベースを用いて行われます。次のステップは、カロン合成に絶対的に必要な5つの遺伝子を選択することです。CSGBとCSGAは繊維モノマーをコードし、C-S-G-E-C-S-G-FおよびCSGGは curling 分泌複合体をコードします。選択した配列をデータベースからFASTA形式で抽出します。C-S-G-G-F-Eクラスターは大腸菌ゲノムにおいてアンチセンスであるため、Clone Managerソフトウェアを用いてデータ管理およびin silicoでの事前解析を行います。

この配列を逆相補配列に変換する必要があります。クローンマネージャーツールの「operations」→「process molecule」→「invert molecule」の手順を用いてください。次に、「ligate」機能を使用して、C-S-G-B-Aの後ろにC-S-G-E-F-G配列を貼り付けます。続いて、C-S-G-B-A-E-F-G iCal配列の前方に、適切なプロモーターPRCNを追加します。

RCN遺伝子座は、ニッケルおよびコバルトの解毒を担うFLXポンプRCNAと、その同族メタロレギュレーターであるRCNRをコードしています。コバルトまたはニッケルが存在しない場合、リプレッサーであるRCNRがDNA上のRCNRボックスに結合し、下流遺伝子の完全な転写活性化を抑制します。細胞内のコバルトまたはニッケル濃度が上昇すると、コバルトまたはニッケルがRCNRタンパク質に結合することでリプレッサーのプロモーターへの固定が妨げられ、選択された5つのcurly遺伝子がプロモーターの制御下に置かれることで、P-R-C-N-Aの転写活性が増加します。

コバルトおよびニッケルの存在下でPRCN curlyが過剰産生されると予測されています。続いて、CS gba DNA配列の最初のATGの前に完全なリボソーム結合部位（RBS）を、またC-S-G-E-F-G配列の前に2つ目の完全なRBSを追加することで、転写シグナルを最適化します。iGEMの基準に適合させるため、デバイスの両端には、今後のアセンブリを容易にするため、EcoRIおよびXbaIの制限部位を含む標準的なバイオブロック・プレフィックスと、SpeIおよびPstIの制限部位を含むサフィックスを配置する必要があります。

バイオブロックのパーツ自体に、EcoRI、PstI、SspI、XbaIの認識部位が含まれていてはなりません。そのため、in silico制限酵素解析によって、CSGA配列に1箇所のPstI部位、RCNR配列に1箇所のPstI部位、そしてCSGE遺伝子に1箇所のEcoRI部位があることが判明したため、これらの部位をサイレント変異によって除去しました。

合成オペロンの設計が完了したら、クローンマネージャーソフトウェアを使用して翻訳シミュレーションを実行します。配列アライメントプログラムであるblastを用いて、野生型curlyタンパク質と合成オペロンによってコードされるタンパク質との間に完全なホモロジーがあることを確認します。この手順を開始するには、24ウェルポリスチレンプレートの各ウェルに、0.2% glucoseを含むM 63最小培地を2 mLずつ分注します。各ウェルに、一晩培養した細菌培養液を10⁶ cells分接種します。細菌を30 °Cで18〜48時間、振盪せずに培養します。24ウェルプレートの各列が1つのモダリティを表します。

必要に応じて、適切な量のコバルトと抗生物質を添加します。最初の3行は、3回の繰り返しを平均することで、付着細菌の量を定量するために使用します。最左列の最終行は、18～48時間後にクリスタルバイオレット染色を行い、バイオフィルムを可視化するために使用します。24ウェルプレートの最初の3行の各ウェルから、プランクトン細胞を含む上清を回収し、その上清を溶血管に移します。

各ウェルを1 mLのM 63培地で慎重にすすぎ、最初の吸引時に溶血管で洗浄液を回収します。この回収液を遊走細胞（S）と呼びます。マイクロプレートのウェル底面には付着細胞が形成されています。バイオフィルムを回収するために、各ウェルに1 mLのM 63を添加します。

ピペットチップで掻き出した後、ピペッティングを行い、バイオフィルム画分を新しい溶血チューブに移します。チューブを15秒間ボルテックスします。バイオフィルム画分を溶血チューブに回収してください。

このプールは、Bと名付けられた表面付着細胞を表します。溶血管から上清およびバイオフィルム分画を200 µL取り出し、96ウェルプレートに転移させます。600 nmにおける吸光度から、表面付着細菌および遊泳細菌の数を推定します。各モダリティの付着率は、数式(B × 100) / (3S + B)を用いて算出します。バイオフィルムを可視化するため、24ウェルプレートの最終行のみ、それらのウェルからプランクトン細胞を除去します。

プレート底面に形成されたバイオフィルムを洗浄するため、各ウェルにM 63を1 mLずつ加えます。蓋を開けた状態でプレートを80 °Cで1時間乾燥させます。1時間後、各ウェルに20%結晶紫を100 µL加え、その後、水で十分に洗浄します。このプロトコルには蛍光シャシが必要です。

合成curliを保持するプラスミドに適した宿主はE. coli SCC1株であり、この株は親株MG 1655と観察上の差がなく、緑色蛍光タンパク質を恒常的に発現します。宿主株に合成curliを保持するpUCK57プラスミドを形質転換し、S23株を得ます。宿主株をコントロールプラスミドpUCK18で形質転換し、コントロール株を得ます。

S 23およびS 24株の前培養を30 °Cで一晩行います。翌日、グルコースおよびアンピシリンを添加したM 63培地を用い、シャーレに20 mLのM 63培地を加え、さらに100 µLの前培養液を15 mLのM 63培地を含むシャーレに接種します。適切な濃度のコバルトを添加し、コバルトを含まないネガティブコントロールも忘れずに用意してください。

各ペトリ皿に3枚の長方形ガラスカバースリップを導入します。皿を30 °Cで振盪せずに一晩インキュベートします。翌日以降、蛍光顕微鏡下で細菌を直接観察することができます。

サンプルの乾燥を防ぐことが重要であるため、以下の手順は慎重かつ迅速に行わなければなりません。各カバーガラスをペトリ皿から取り出し、注意深く液を切り落とします。共焦点観察に向けて、70%ethanolを浸した小さな綿棒で下面を丁寧に清掃し、細菌の残渣をすべて拭き取ります。

バイオフィルムの上面が上を向くようにして、カバーガラスをガラススライドの上に置きます。次に、バイオフィルムをより大きなカバーガラスで覆い、バーニッシュを用いてガラススライドに固定します。

セットアップを反転させ、バイオフィルムが下面に来るようにします。本実験では、このセットアップを共焦点レーザー顕微鏡の下に配置します。CTマイクロプラットフォーム内でZeiss LSM 510 Meta共焦点レーザー顕微鏡を使用します。

40倍の油浸対物レンズを選択します。設定は、GFPを488 nmで励起させ、500 nmから600 nmの範囲で細菌の蛍光を収集するようにしてください。画像の取得には40倍の油浸対物レンズを使用します。

レーザー走査型共焦点モードにおいて、固体表面から培地との界面まで、バイオフィルムの全体的な三次元構造を1 µmステップでスキャンします。

mausソフトウェアを用いて3次元投影を行い、統計的な縦断断面における平均C値の解析によってバイオフィルムの厚さを決定します。共焦点Zスタックから、バイオフィルムの定量化およびバイオボリュームを抽出できます。金属に応答してcurlyを過剰産生するように構築されたe coliの付着能は、簡便な方法で評価可能です。

例えば、24ウェル研磨済みIreneプレートを用いたクリスタルバイオレット染色は、紫色の色の濃淡で示されるように、各ウェルの底面におけるバイオフィルム形成の迅速な可視化を可能にします。野生型株は、エンジニアリング株よりも付着性が低いことが分かります。定量的な手法としては、さまざまな濃度のコバルトを用いた条件下で、野生型株とエンジニアリング株のポリスチレンへの付着率を測定する方法があります。

このグラフに示された結果から、コバルト不在下において、改変株の付着率は野生型株よりも1.5倍高いことがわかります。さらに、コバルト濃度の増加に伴い付着が顕著に強化されることが観察され、コバルト濃度25 µMおよび50 µMの培地では、改変細胞の付着率はそれぞれ30%および40%に達しました。付着能は、ガラススライド上で培養したGFPタグ付き細菌を用いた顕微鏡観察によっても比較可能です。エピ蛍光顕微鏡を用いて黒色の背景上の緑色細菌を観察したところ、野生型株が矢印で示されるマイクロコロニーのみを形成するのに対し、改変株はバイオフィルムを形成することが明らかになりました。

共焦点顕微鏡解析により、バイオフィルムの三次元構造の全体像が得られます。パネルAに上面からの再構成図を、パネルBに側面からの再構成図を示します。その結果、エンジニアリングされた株は野生型よりも付着性が高く、より緻密で厚いバイオフィルムを形成することが確認されました。この手順を行う際は、例えば放射性廃水という条件下での改変E. coliまたはOccus antsのバイオメディエーション能を探索する場合など、操作設計を再確認することが重要です。

このビデオを視聴することで、クローンマネージャーソフトを使用して合成オペロンを設計する方法と、細菌株の発現量を迅速に定量化する方法について十分に理解できるはずです。合成遺伝子や遺伝子組み換え生物の取り扱いは極めて危険であることに留意してください。これらの取り扱いは、現行の法律に従い、形質転換した細菌のオートクレーブ滅菌などの予防措置を講じた上で行う必要があります。