マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いて、ナノ粒子および細菌の細胞内取り込みの細胞メカニズムを解析します。まず、アクチン重合を抑制するために、マクロファージをcyto chalasin Dで前処理します。その後、マクロファージ単層にナノ粒子またはsalmonellaを添加し、インキュベートします。

その後、マクロファージを回収し、固定して、イメージストリームを用いた解析のためにラベル付けします。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーにより、ナノ粒子および/またはサルモネラを内部に取り込んだ細胞を、ナノ粒子および/またはサルモネラが表面に結合している細胞と区別します。得られたデータは、サルモネラとナノ粒子の両方が、cyto klainで処理されていない細胞にのみ取り込まれることを示しています。

Dは、内在化がアクチン依存的であることを示唆しています。この手法は、フローサイトメトリーや共焦点顕微鏡などの既存の手法と比較して、いくつかの利点があります。主に、蛍光信号強度の正確な測定と、異なる細胞構造間の空間分解能を高速で提供できる点にあります。

この手法は、バイオマテリアルを用いたワクチンやドラッグデリバリーの研究、および宿主と病原体の相互作用に関する多くの研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。これには、ポリアンヒドライドナノ粒子や細菌が利用するインターナリゼーション経路の解明が含まれます。一般的に、この手法を初めて行う方は、習得に苦労することが多いです。

最適な蛍光信号を得るためには、染料のタイトレーションに時間をかけることが重要です。また、ソフトウェアに習熟し、解析テンプレートを作成することにも時間を要します。私たちは、顕微鏡観察やその他の手法を用いて、ポリハイドロナノ粒子が病原体模倣特性を示すことを見出した際に、初めてこの手法を考案しました。

次に、アッセイを実施する前に、サルモネラ菌と花粉ハイブリッドナノ粒子が用いる内部移行プロセスを比較するためのハイスループットシステムを構築しました。すべての哺乳類および細菌の細胞培養物を回収し、ナノ粒子懸濁液を調製しておく必要があります。まず、セルスクレイパーを用いて、コンフルエントとなった RAW 264.7 細胞を回収することから始めてください。

ヘモサイトメーターを用いて細胞数を測定します。次に、細胞を24ウェル培養皿に、1ウェルあたり0.5 mLのComplete DMEMを用い、5×10⁵ cells/wellの密度で播種します。37 °C、5% CO2インキュベーター内で一晩培養します。

Salmonella taricaを調製するため、16 × 125 mmのオートクレーブ対応ねじ蓋付きガラス培養チューブ内で、RA W2 64.7細胞に対して感染多重度100となるように、C-D-M-E-MでSalmonellaを希釈します。次に、滅菌済みウェイペーパーを使用し、Pharmaceutical Research誌におけるReanらによる2009年の論文で述べられている方法で生成された1% FITC封入ポリアンヒドリドナノ粒子 5 mgを、1.5 mLマイクロ遠心チューブに量り取ります。このナノ粒子を0.5 mLの冷PBS（リン酸緩衝生理食塩水）に加え、氷上に置きます。

チューブを氷上に保持します。マイクロチップ付き超音波液体プロセッサーを使用し、懸濁液を4〜6 jouleで約25秒間ソニケーションします。これで必要な細胞と試薬の準備が整ったため、食作用アッセイを実施できます。

1枚目のプレートでアッセイを行う準備として、RA W2 64.7細胞を培養した24ウェル組織培養プレートにラベルを貼ります。以下の各サンプルを3連（triplicate）でアッセイします：cyto and Dおよびナノ粒子、cyto and Dおよびsalmonella、培地およびナノ粒子、培地およびsalmonellaナノ粒子のみ、salmonellaのみ、およびAF six 60染色細胞のみ。2枚目のプレートでは4 °Cのコントロールをアッセイし、これには培地＋ナノ粒子および培地＋salmonellaが含まれます。この低温でのインキュベーションにより、食作用などの細胞プロセスが遅延します。誘導の1時間前に、5 µg/mLのcyto and DおよびC-D-M-E-Mを適切なウェルに添加し、細胞を37 °Cでインキュベートします。

インキュベーション後、ナノ粒子懸濁液をボルテックスし、適切なウェルに10 µLずつ加えます。次に、salmonellaをボルテックスし、MOI 100で適切なウェルに加えます。プレートを数回軽く叩いて混ぜ合わせます。

次に、サンプルプレートを37 °Cで、陰性コントロールプレートを4 °Cで45分間静置します。インキュベーション後、プレートを氷上に置き、古い培地を吸引して除去することで、未結合の粒子、salmonella、および死細胞または脱落細胞を取り除き、カルシウムおよびマグネシウムを含まない氷冷PBSで細胞を2回洗浄します。petal magnesiumを使用します。

この段階でPBSで前処理を行うことは、基質からの細胞剥離を促進するため不可欠です。細胞を回収するには、氷冷PBS 250 µLを加え、ウェルを穏やかにスクレイピングし、回収した細胞をシリコン処理済みのスナップキャップ付きマイクロ遠心チューブにピペッティングして、氷上に保持します。冷した洗浄緩衝液 1 mLを加えて細胞を洗浄し、4 °Cで250 ×g、10分間遠心分離します。上清を廃棄した後、マイクロ遠心チューブを逆さまにして紙の上で叩き、残留緩衝液を除去します。

マイクロ遠心チューブをテストチューブラックの上で軽く転がすように動かし、細胞ペレットを再懸濁させます。細胞を固定するため、PBSで調製した4%パラホルムアルデヒドを100 µL加え、15分間静置します。室温で、Perm Wash Bufferを1 mL加えて細胞を洗浄し、その後4 °Cで10分間、250 ×gで遠心分離します。

上清を廃棄した後、前述と同様に残留バッファーを除去します。次に、RA W2 64.7細胞を染色します。アクチンについては、Alexa Fluora foidを含むperm wash buffer 100 µLを加え、15分間静置します。

室温にて、未染色のサンプルをphinを含まないperm、洗浄バッファーとともにインキュベートします。染色後、細胞を再度洗浄および遠心分離し、1% PFAを含む50 µLのPBSに再懸濁して、データ取得まで4 °Cの暗所で保存します。電源を入れ、イメージストリームを開始し、起動します。

ファイルメニューから流路系のインスパイアおよび初期化を行います。「load default template」を選択してください。イメージギャラリーのビューメニューで「select all」を選択し、「run setup」を押してビーズのイメージングを開始します。必要に応じて、コアトラッキングを調整して画像を左右の中央に配置してください。

明視野チャネルを選択し、[set intensity]をクリックします。フロー速度の変動係数が一貫して0.2%未満になるまで待ちます。[assist]タブで[start all]をクリックして校正とテストを実行し、ソフトウェア上ですべて合格したことを確認します。[load sample]をクリックします。

次に、指示があった時点で、最も輝度の高いサンプルが入ったバイアルをセットします。サンプルローダーにすべてのフルオロクロムを配置し、40倍の倍率を選択してください。一度機器の設定が完了したら、実験全体を通して設定を変更しないでください。

ソフトウェア上のレーザーアイコンをクリックして、実験に使用する各レーザーをオンにし、散布図で測定される各フルオロクロムの最大ピクセル値が104,000カウントになるようにレーザー出力を設定します。不要なオブジェクトの収集を排除するため、ソフトウェアのセル分類器（cell classifier）ウィンドウをクリックします。次に、細胞データのみを収集するために、明視野（brightfield）のarea lower limit channel oneを選択し、値を50 µmに設定します。これにより、面積が50 µm未満のオブジェクトはデブリとみなされ、取得されません。

ソフトウェアのここにある適切なチャンネルアイコンをクリックして、収集するチャンネルを選択します。セットアップタブでチャンネル1、2、3、4、5、および6を選択します。ファイル番号と保存先フォルダを入力してください。

シーケンス番号を1に、収集するイベント数を5,000に設定します。「run, acquire」をクリックして、1番目の実験データファイルを収集し、保存します。「FLL」をクリックし、次の実験サンプルを実行します。

すべての実験サンプルの収集が完了するまで、この操作を繰り返します。次に、コントロールを測定するため、「comp settings」をクリックします。これにより、明視野および散乱レーザーがオフになり、「acquire」タブですべての蛍光チャネルの収集が可能になります。

入力値を500に変更します。次にコントロールチューブをセットし、runをクリックします。単色染色コントロールにおいて、500個の陽性細胞を収集するまで計測を行います。

補正マトリックスを作成するため、実験に使用する各蛍光色素について同様の操作を繰り返します。すべてのサンプル画像の取得が完了したら、デスクトップ上のideasアイコンをダブルクリックして、別の解析用コンピュータでideas解析ソフトウェアを起動します。インターナライゼーションウィザードをダブルクリックし、テストサンプルのRIFファイルのいずれかを読み込みます。

ポップアップウィンドウにテストファイルの読み込み手順が表示されます。指示に従い、「次へ」ボタンをクリックしてください。次に、「新規マトリックス」をクリックします。

これにより、コンペンセーションウィザードが起動します。指示が表示されたら、シングルカラーコントロールのデータファイルを選択して追加してください。ウィザードの指示に従って「次へ」をクリックし、コンペンセーションマトリクスファイルが保存され、インターナリゼーションウィザードのステップ2のボックスにロードされるまで操作を続けます。

「次へ」をクリックし、DAFファイルが生成されるまで指示に従います。撮影時に使用した画像チャンネルを選択して、画像表示プロパティを設定します。FITCにはチャンネル2を、AF 660にはチャンネル5をクリックしてください。

デフォルトで明視野（Brightfield）とサイドスキャッターが選択されます。細胞境界を設定するために明視野チャンネル O を選択し、内部化プローブとしてナノ粒子や細菌が回収されたチャンネル O2 を選択して単一細胞集団を定義すると、全細胞の明視野面積に対する明視野アスペクト比の散布図が生成されます。複数のデータファイルをハイスループット解析するにはテンプレートファイルが必要であるため、テンプレートファイルの作成時にゲートを慎重に定義することが極めて重要です。

各ドットは個々の細胞画像の値を表しています。グラフ上のドットを1つクリックすると、画像ギャラリーでその特定の細胞の画像が選択されます。

次に、単一細胞イベントに相当する面積とアスペクト比を持つ細胞を囲むゲートを作成します。単一細胞のアスペクト比は約1であり、ダブレットのアスペクト比は約0.5となります。

複数のセルをクリックし、単一細胞を含む領域と、ダブレット（凝集細胞）またはデブリ（細胞残渣）を含む領域を区別します。明視野画像の明視野グラディエント平方根平均二乗のヒストグラムを生成するには、次へボタンをクリックしてください。

次に、「population」タブの下にある「bin」オプションを選択して、選択したビンを表示します。ビンをクリックして、細胞がどこにあり、どこが最適なフォーカスであるかを確認します。「Begin」をクリックし、線形領域を描いて、フォーカスが合った細胞をゲートします。

勾配のRMSが高いほどピントが合っていることを示します。ゲートをかける他の染色がない限り、次のステップはスキップしてください。X軸にチャネル2の強度、Y軸にチャネル2の最大ピクセル値を配した新しい散布図が生成されます。ドットをクリックして画像を確認し、ナノ粒子または細菌に陽性の細胞を囲む領域を決定してください。

インターナリゼーション機能のヒストグラムが、0から始まる領域と共に生成されますが、これは画像を観察して調整する必要があります。インターナリゼーション機能は、細胞内部の強度と細胞全体の強度の比率です。これは、値が0のときに強度の半分が内部にあるようにスケーリングされています。

ウィザードは、入力された細胞画像を用いて細胞表面を特定し、それを4ピクセル侵食させることで、細胞内部を指定する各細胞の領域（マスク）を作成しました。なお、必要に応じて、まず明視野画像上でオブジェクトマスクを作成し、それをより多くまたは少なく侵食させることで、異なる細胞型に合わせてこのマスクを手動で調整できます。インターナリゼーション機能は、ソフトウェア内のアルゴリズムを使用して、この侵食されたオブジェクトマスクに基づいて算出されます。

この機能により、この例に示すように、蛍光シグナルの大部分がマスク境界内にある内部移行した粒子や細菌を、蛍光シグナルの大部分がマスク境界外にある表面結合粒子や細菌から区別することが可能になります。侵食処理されたオブジェクトマスクに基づき、新しい内部移行機能を用いた新しいヒストグラムを作成します。選択ビンモードで画像を確認し、内部移行した細胞をゲートするための領域を描画します。ゲートを0.3に設定します。

スコアが0.3未満の細胞は、表面結合粒子陽性細胞とみなされます。バックグラウンド標識のある細胞を除去し、特異的に内部移行したナノ粒子または細菌を同定するには、解析メニューから機能を選択してください。解析メニューをクリックします。

次に、スポットカウント機能をクリックして、統計レポートに平均スポットカウントを追加します。レポートメニューで、レポートアイコンをクリックします。次に統計レポートを定義し、列を追加して、適切な細胞集団を選択します。

OKをクリックします。内部化ウィザードによって、このレポートに統計情報が自動的に追加され、データファイルが、すべての実験ファイルのバッチ解析に使用されるテンプレートファイルとして保存されます。ファイルメニューをクリックし、[テンプレートとして保存]を選択します。

テンプレートファイル。Ideaソフトウェアで複数のデータファイルを解析するには、拡張子を.ASTにします。[Tools]をクリックして[Batch data files]を選択し、すべてのRIFファイルをインポートしてください。

対応するセクションに補正マトリックスファイルとテンプレートファイルを追加して、バッチ処理を送信し、「submit」をクリックします。処理ステップの後、すべてのRAFファイルが解析され、個々のrawファイルに対してDAFファイルが生成されます。最終レポートが作成され、すべてのサンプルの統計データを用いて、アクチン阻害および低温がsalmonellaおよびナノ粒子の食作用に及ぼす影響を比較します。

RA W2 64.7細胞を、Cytochalasin Dを含むか含まない培地中で37 °Cでインキュベートしたか、あるいは4 °Cの培地中でインキュベートした。温度およびアクチンの操作はいずれも、ナノ粒子とSalmonellaの両方の内部移行を減少させた。しかし、細胞をCytochalasin Dでインキュベートすると、表面にナノ粒子が結合している細胞の割合は増加したが、表面にSalmonellaが結合している細胞の割合は減少した。

表面にナノ粒子が結合した細胞の割合は、37 °Cでの約 8% から、Cytochalasin D 処理または 4 °C 処理後に 35% 以上へと増加しました。対照的に、表面に Salmonella が結合した細胞の割合は、Cytochalasin D 処理により 35% から 15% に減少しました。RAW 264.7 細胞を 4 °C で Salmonella と共にインキュベートしたところ、37 °C のコントロールと比較して、表面結合細菌量に明らかな増加は見られず、内部移行が減少しました。以上のデータは、Salmonella とナノ粒子が、アクチンを必要とし温度依存的な同様の細胞プロセスによって内部移行することを実証しています。

さらに、サルモネラのマクロファージへの持続的な付着には、アクチン重合が必要であることがデータで示されています。このビデオを視聴することで、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いて、ナノ粒子や細菌の細胞内取り込みをどのように解析するかについて十分な理解を得ることができます。この手順を行う際は、阻害剤に細胞毒性があることに留意することが重要です。

したがって、使用する最適な濃度を決定するために、事前に細胞毒性プロファイリング試験を行う必要があります。salmonellaの取り扱いは危険を伴う可能性があるため、本手順を実施する際は、適切な個人用保護具の着用やエアロゾルの発生防止など、必要な予防策を講じることを忘れないでください。