ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

この手順の全体的な目標は、非ウイルス性高分子ナノ粒子を用いた遺伝子導入実験を実施し、評価することです。これは、最初に遺伝子導入粒子で細胞をトランスセクトすることによって達成されます。次に、トランスフェクション効率を顕微鏡法およびハイスループットフローサイトメトリー分析によって評価します。

次に、ナノ粒子追跡分析装置を用いて、ナノ粒子サイズ分布、濃度、粒子当たりのプラスミドを決定します。最終的に、この方法により、ナノ粒子サイズの特性評価と、ナノ粒子を使用したトランスフェクション効果が可能になります。遺伝子導入に生分解性高分子ナノ粒子を使用する主な利点は、他の遺伝子導入方法よりも安全で効果的であることです。

動的光散乱などの既存の方法に対するナノ粒子追跡分析の主な利点は、ナノ粒子追跡分析が数、平均分布、粒子濃度を直接得ることです。この方法は、共発現研究に重要な粒子あたりのプラスミド数など、非ウイルス性遺伝子導入分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。以下のプロトコルは、ヒト網膜内皮細胞またはhreをモデル細胞として、ポリベータアミノエステルまたはPBA AEをモデルポリマーとして使用して実証されています。

なお、24時間前に使用した細胞やポリマーによっては、培養条件や溶媒の調整が必要な場合があります。トランスフェクション。マルチチャンネルピペットを使用して、平らに処理された透明な組織培養物にhreを播種します。マイクロリットルあたり25〜50細胞の濃度で下部の96ウェルプレート。

これにより、トランスフェクションの日に70〜80%coの流暢さが得られ、処理された透明な非組織培養を調製し、標識することができます。96ウェルプレートは、PBAとDNAを調製し希釈するためのマスタープレートとして機能します。同一のプレートを2枚ご用意いたします。

1つは毒性の評価用、もう1つはトランスフェクション効率の評価用です。ポリベータアミノエステルまたはPVAEポリマーとP-E-G-F-P-N 1D NAストック溶液を室温で追って使用してください。ホーニングしたら、12チャンネルピペットを使用して、各条件について25ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝液に0.06ミリグラム/ミリリットルのDNAを50マイクロリットル含むウェルを調製します。

次に、同じプレートで、PBAEポリマーを酢酸ナトリウム緩衝液で1ミリグラム/ミリリットルに希釈します。次に、PBAEポリマーをさらに希釈して、ポリマー重量とDNA重量比が30マイクロリットルと60マイクロリットル、および50マイクロリットルの酢酸ナトリウム緩衝液に希釈します。ナノ粒子の形成には、12チャンネルピペットを使用して、50マイクロリットルの希釈PBAと50マイクロリットルの希釈血漿DNAをピペッティングで上下させて激しく混合します。

次に、混合物を室温で10分間インキュベートして、自己組織化させます。自己組織化後、12チャンネルピペットを使用して、この図に示すように、12チャンネルピペットを使用して、条件ごとに4つのウェルをトランスフェクションする培地を含む播種細胞の各ウェルに20マイクロリットルのナノ粒子溶液を滴下します。各プレートについて、ネガティブコントロールとポジティブコントロールのそれぞれについて少なくとも4つのウェルを予約します。

ネガティブコントロールは未処理の細胞とポジティブコントロールで構成され、リポ2000やFuge hdなどの市販の試薬でトランスフェクションされた細胞で構成されています。トランスフェクションされた細胞とプレートを摂氏37度で4時間インキュベートしますインキュベーション後、12チャンネルピペットを使用して細胞から培地を取り出し、新鮮なhreのウェルあたり100マイクロリットルと交換します。培地でさらに24〜48時間インキュベートします。

翌日、インキュベーターからプレートを1つ取り出します。蛍光顕微鏡法で細胞トランスフェクションと毒性を評価し、添付のテキストに記載されているように、細胞力価96水系Oneアッセイを使用して細胞毒性を定量します。48時間後、もう一方のプレートをインキュベーターから取り外します。

添付のテキストで説明されているように、蛍光、顕微鏡法、およびフローサイトメトリーによりトランスフェクション効率を評価します。ここで取得した毒性およびトランスフェクションのデータを使用して、将来の実験に使用するPBAの最適な濃度を決定してください。ナノサイトNS 500は、0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブ内でナノサイトの流体システムを使用する前に、個々のナノ粒子の拡散を追跡することにより、ナノ粒子サンプルのサイズ分布に関する情報を提供できるナノ粒子追跡分析装置です。

PBAと血漿DNAを、このビデオの前のセクションで使用したのと同じ濃度で、以前と同様に分析用に調製します。自己組織化後、ナノ粒子溶液を新しい1.5ミリリットルチューブでPBSで100倍に希釈し、少なくとも500マイクロリットルの最終容量を得る。これにより、ナノ粒子追跡分析に適した範囲のナノ粒子濃度が得られます。

次に、サンプルをナノサイトにロードします。気泡を導入しないように注意してください 目視で確認して、画面に20〜100個の粒子があることを確認してください。ナノ粒子追跡の理想的な数は、約50個の粒子です。

多すぎるまたは少なすぎる場合は、NS 500をフラッシュし、希釈をPBSに調整して、サンプルを再ロードします。画面上のパーティクルの数が20〜100の場合、ビデオをキャプチャします。ビデオがキャプチャされたら、同じソフトウェアでビデオファイルを開いて処理段階に進みます。

次に、ファイルが開いたら、画面のゲインを上げます。画像パラメータの自動調整を選択するには、適切なボックスをクリックします。画面上の粒子がソフトウェアによって認識されると、赤い十字でマークされます。

すべての粒子がマークされたら、ソフトウェアのプロセスボタンをクリックしてビデオファイルを処理します。次に、粒子サイズ、分布サイズの平均、および粒子濃度が表示され、粒子数が正確であることが確認されます。同じサンプルを 2 x と 4 で希釈して、この手順を繰り返します。

PBS APREのForexは、このビデオに示すように、E-G-F-P-P-B-A-Eナノ粒子でトランスフェクションされました。トランスフェクション効率を視覚的に評価するために、蛍光顕微鏡イメージングを実施しました。これらの画像は、トランスフェクションされた細胞の蛍光明視野および結合画像を示しており、結合画像に見られるように、細胞の大部分はEGFPを発現し、正常な形態を維持しています。

トランスフェクション効率を定量化するために、この図に見られるように、生集団でのゲーティング後にフローサイトメトリーを実施しました。未切除の集団にはEGFP陽性細胞が含まれていなかった。しかし、処理された細胞の71.6%はEGFPナノサイトに陽性でした ナノ粒子追跡分析を使用して、ナノ粒子サイズの分布と濃度を決定しました。

この分析では、粒度分布がモノ分散であることが重要です。この情報を使用して、溶液中のプラスミドの濃度をNS 500によって決定された粒子濃度で割ることにより、粒子あたりのプラスミドの平均数を計算できます。粒子あたりのプラスミドの数は、粒子サイズ分布を反映した分布です。

サンプル内には、粒子あたりのプラスミドの値が平均よりも大きい大きな粒子と、粒子あたりのプラスミドの値が平均よりも低い小さな粒子があります。この手順を試みる際には、ncyを使用するためにナノ粒子を細胞に添加する前に、分解性ポリマーを水溶媒に長時間留まらせないように注意し、サイジングに適した希釈を調整することが重要です。このビデオを見れば、非ウイルス性遺伝子導入ポリマーを用いた接着細胞タイプのトランスフェクション方法、トランスフェクション効果の測定方法、粒子径分布の測定方法について十分に理解できるはずです。

人間の細胞を扱うことはバイオハザードであることを忘れないでください。この手順を実行するときは、常に個人用保護具を着用し、バイオセーフティキャビネットで作業してください。