Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

この手順の全体的な目的は、A, b, Cトランスポーター（この場合はマルトーストランスポーターmalf GK 2）を可溶性膜ナノディスク粒子に組み込むことです。これはまず、膜スキャフォールドタンパク質MSPを、トランスポーターおよび適切な量の脂質とともに界面活性剤ミセル内で混合することで達成されます。

第2ステップでは、ポリスチレンビーズを添加し、混合物を一晩緩やかに揺動させます。これにより、界面活性剤が徐々にビーズに吸収され、ナノディスク粒子が形成されます。次に、沈降によってビーズを除去します。最終ステップとして、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、適切に形成されたディスクを、凝集体および未アセンブリのスキャフォールドタンパク質から分離します。

最後に、ネイティブゲル電気泳動または光散乱分光法によりディスクの品質を評価します。リポソームなどの他の手法と比較した本手法の主な利点は、膜タンパク質とディスクが水溶液中で完全に可溶であることです。さらに、タンパク質ドメインの両側からアクセスが可能になります。

膜コンパートメントを必要としないため、異なる長さの膜スキャフォールドタンパク質を用いることで、膜タンパク質のさまざまなリガンド状態を捕捉し研究することができました。最も重要な点は、この手法がABCトランスポーターの新規結合パートナーの同定など、膜プロテオミクス分野における重要な疑問への回答に寄与できることです。実際、この技術の意義は治療法への応用にも及び、膜タンパク質や受容体の活性化剤または阻害剤の発見に役立つ可能性があります。

この方法は単純に見えますが、適切なタンパク質と脂質の比率を選択する際には注意が必要です。一般的に、この方法に不慣れな人は、適切なモル比の算出や、調製の品質を保証するための適切なコントロールの設定に苦労することがあります。したがって、この方法を視覚的に実演することは、新しい学生がさまざまな手順や潜在的な困難を学ぶ上で非常に有用です。

大腸菌BL21(DE3)株を用い、プラスミドpMSSP1D1からヘキサヒスチジンタグ付きMSPを発現させます。600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が約0.5に達した時点でタンパク質発現を誘導し、37 °Cで3時間培養後、4 °Cにて5,000 ×gで10分間遠心分離して細胞を回収します。得られたペレットを100 µM PMSFを含むTSG10バッファーで再懸濁し、フレンチプレスを用いて8,000 psiで3回細胞を破砕します。4 °Cにて5,000 ×gで10分間遠心分離して不溶性物質を除去します。その後、125,000 ×gで45分間超遠心分離を行い、MSPを含む可溶性画分を分離します。

TSG 10緩衝液を用い、約1.5 mLのNickel Sepharose High Performanceを使用したニッケルキレートクロマトグラフィーによりMSPを精製します。50 mMイミダゾールを含むTSG 10緩衝液で不純物を洗浄します。透析後、600 mMイミダゾールを含むTSG 10緩衝液を用いてMSPを溶出させます。

TSG 10バッファーMSP中の精製タンパク質は、-70 °Cで、タンパク質濃度を約10から15 mg/mLにして保存することができます。MAL KのC末端にHisタグが付加されたMALF GK 2複合体は、プラスミドpED 22 FG Kから発現させます。E. coli株BL 21(DE3)で培養し、600 nmにおける吸光度（OD600）が約0.5に達した際に0.2% L-アラビノースを添加し、37 °Cで3時間誘導してタンパク質を産生させ、その後、細胞溶解および遠心分離を行います。

前回と同様に、メンブレンペレットをTSG 20バッファーに懸濁し、最終濃度を5 mg/mLにします。次に、1% (w/v) GDMを用いて、4 °Cで3時間緩やかに振盪しながら材料を可溶化します。MAL FTK 2の精製時と同様に、超遠心分離によって不溶物を除去します。

次に、可溶化されたmal FTK two複合体を含む上清を回収し、ニッケルキレートクロマトグラフィーで再度精製します。さらに、TSGDバッファーを用い、SUEx 200, HR ten three hundredカラムにて、流速0.5 milliliters per minuteでゲルろ過クロマトグラフィーを行い、複合体を精製します。リン脂質を調製するため、クロロホルムに溶解したe coli全脂質抽出物を、スクリューキャップ付きマイクロフィージチューブに1000 anomalずつ分注し、穏やかな窒素気流下で溶媒を蒸発させた後、真空状態で一晩さらに乾燥させます。

次に乾燥させ、脂質膜を最終濃度 5 NMO の TS バッファーで溶解し、激しくボルテックスした後、約 5 秒間のパルスソニケーションを 5 回行います。溶解した脂質は、水溶性 TS バッファーに対する一般的な不溶性のためにわずかに不透明に見えますが、懸濁状態を維持している必要があります。DDM を最終濃度 0.5% になるように添加します。この時点で溶液は透明になります。脂質混合物をウォーターバスに入れ、約 5 秒間のパルスソニケーションを 5 回行います。

脂質混合物は4°Cで最大1週間まで保存可能です。バイオビーズを準備するには、約10〜15 mLのバイオビーズを50 mLチューブに入れます。まず、100% methanol 50 mLでビーズを洗浄します。

ビーズを重力で沈降させ、その後、溶液を静かに捨てます。この工程を、メタノールで1回、次に95% Ethanol、milli Q water、最後にTS bufferでそれぞれ2回ずつ繰り返します。MSPをTSGD bufferで希釈し、最終濃度を約7 mg/mLまたは0.3 mMにして、ナノディスクの構成を開始します。

実験を成功させるためには、混合させる脂質とタンパク質の比率を正しく選択することが重要です。精製したmalf GK two complex 約2 µMを、タンパク質：MS P：脂質の比率を1:3:60としてTSGDバッファーで混合し、最終容量を300 µLにします。ここでは、陰性対照として、脂質を過剰に加えた1:3:400の比率のサンプルも調製します。チューブにbio bead懸濁液50 µLを加え、ロッキングテーブルを用いて4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、重力でビーズを沈殿させます。ビーズが沈殿したら、bio beadを可能な限り取り込まないよう、細いチップを用いて溶液をピペッティングします。

100,000 gで20分間の超遠心分離を行い、大きな沈殿物を除去します。その後、前述の手順に従い、TSG 10バッファーを用いてゲルろ過クロマトグラフィーによりディスクを精製します。次に、調製物の安定性を確認するため、同じゲルろ過カラムにEloquaを注入します。

次に、ディスクを含む分画を回収します。調製物の品質は、ネイティブゲル電気泳動によって評価します。1 µMのナノディスクを分析し、再構成の品質を評価してください。

また、ナノディスク内で再構成したmal Eとmal ftk 2複合体の結合を評価します。電気泳動後、ゲルをクマシーブルーで10分間染色し、約1時間脱色します。動的光散乱法（DLS）を行うには、まず前述と同様に、Superdex 200 Increase 10/300カラムを用い、流速0.1 mL/minでゲルろ過クロマトグラフィーによりナノディスクを精製します。

ナノディスクを含む画分を回収し、AmCon遠心フィルターを用いて約10 mg/mLまで濃縮します。その後、サンプルを2回ろ過します。dynapro nano star装置を用い、内容量1 µLのクォーツキュベットでDLS分析を行います。

ダイナミックソフトウェアを用いて粒子の直径と分子量を推定し、コロリメトリックアッセイを用いて、mal FTK 2で再構成したナノディスクのATPアーゼ活性を決定します。まず、1 µMの精製ディスクと1 mMのATPを、増加量のmal eと混合します。サンプルを37 °Cで20分間インキュベートします。

次に、660ナノメートルで無機リン酸の放出量を測定します。放出されたリン酸量を、リン標準溶液を用いて作成した標準曲線と比較します。ナノディスクはゲルろ過クロマトグラフィーによって精製します。

クロマトグラムから、再構成されたディスクの大部分が単一のピークとして溶出することがわかります。一方、過剰な脂質を用いて作製されたディスクは、空隙容量に溶出するか、あるいは一連のブロードなピークとして溶出します。ディスク調製の品質は、さらにネイティブゲル電気泳動によって分析されます。限定量の脂質で再構成されたディスクはネイティブゲル上でシャープなバンドとして移動しますが、過剰な脂質の存在下で再構成されたものはスマアリングとして移動します。DLS分析の結果、ディスク集団は均質であり、平均半径は5.0 nanometersであることが示されました。DLSの近似に基づくと、再構成されたディスクの見かけの分子量は215 kilodaltonsです。過剰な脂質の存在下で再構成されたサンプルは、100 nanometers付近に広く分布する半径を示しており、これは不均一なサンプルに典型的な結果です。

MAL FTK2複合体の活性は、TP加水分解速度およびマルトース結合タンパク質であるMAL Eなどの相互作用パートナーへの親和性を測定することで評価されます。MAL Eは、非変性ゲル電気泳動を用いて、MAL FTK2トランスポーターに高い親和性で結合します。MAL EとMAL FTK2の間の複合体を検出することが可能であり、ここではMAL E濃度に応じたMAL KA TPA活性の促進が示されています。

ナノディスクの作製は比較的単純ですが、最適条件からわずかに逸脱するだけで不可逆的なタンパク質の凝集につながる可能性があります。この手法を習得すれば、2日以内に完了させることができます。本手順を実施する際は、適切なタンパク質と脂質の比率を選択することが重要です。脂質が過剰になると、多分散性の大きなリポソーム様の粒子が生成されるためです。そのため、ゲルろ過以外の手法、例えば光散乱分光法、分析超遠心法、あるいはより簡便なネイティブPAGE（非変性ゲル電気泳動）などを用いて、再構成した物質の品質を慎重に分析することが極めて重要です。

ディスクに組み込まれるリン脂質の種類や膜スキャフォールドタンパク質の種類が、再構成の効率に影響を与える可能性があることに留意してください。このビデオを通じて、目的の膜タンパク質を含む可溶性で均一なナノディスクを生成する方法について、十分に理解していただけたなら幸いです。皆様の実験の成功をお祈りいたします。