イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

この手順の全体的な目的は、植物の葉にある気隙によって引き起こされる生物学的画像の劣化を最小限に抑え、葉内部の生細胞のより鮮明な画像を取得することです。葉を水溶性の封入剤で封入し、レーザーで蛍光色素を励起させた場合、オレンジ色で示されている組織内の多くの未充填の気隙や屈折率の変化が、得られた画像における組織深部からの信号強度を制限します。代わりに葉をパーフルオロデカリン（PFD）で封入すると、蛍光色素のレーザー励起による減衰が抑えられ、放出された信号の透過性が向上します。

最終的に、PFD封入剤を用いた共焦点走査型レーザー顕微鏡の使用により、水溶性封入剤を用いた場合に比べて2倍以上の深さまで、植物葉内の生細胞の鮮明な画像を得ることができます。固定法や葉の封入および水溶性媒体などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、葉肉組織内の屈折を低減し、これまで困難であった葉の深部にある生細胞のより正確なイメージングを可能にする点にあります。この手法は、葉肉細胞の生物学や生体内（in vivo）でのシグナル伝達、病原体による葉への定着および病原体と植物の相互作用への対応など、植物科学における重要な疑問の解決に寄与し、基礎的な植物生物学への洞察を提供することができます。

本手法は、蝸牛や脊椎動物の肺など、空気腔に富む他の高屈折組織にも適用可能です。この手順の実演は、私の研究室のGeorge Littlejohn博士が行います。PFDサンプルにおいては、まずポリジメチルシロキサン（PDMS）のガス透過性ガスケットを用いて顕微鏡スライドを準備します。PDMSは、実験要件に合わせて調整したチャンバーを形成できる粘弾性ポリマーです。

空気で満たしたボトルの中で少量のPFDを振とうし、PFDを空気で平衡化させます。これは、PFDに空気をバブリングすることでも達成可能です。次に、PFDをオープン Petri ディッシュにデカンテーションし、苗全体または切り出した葉を液体に5分間浮かべます。組織は、ガラス化組織を彷彿とさせる半透明の状態になります。

照明条件や使用した組織の齢によって、葉はPFDにさらされる前よりも色が濃く、あるいは薄く見える場合があります。最後に、PDMSチャンバーにエアレーションしたPFDを満たし、培養用ペトリ皿から組織サンプルを慎重にPDMSチャンバーへ移します。スライドをカバーガラスで封じ、イメージングを行います。

実験要件に従い、数ヶ月経過した葉を組換え緑色蛍光タンパク質（GFP）懸濁液中で5分間インキュベートした。PFD顕微鏡観察の結果、PFDでインキュベートした葉サンプルの大部分の気腔に、PFD中に懸濁した組換えGFPが充満していることが示された。GFPは緑色で表示され、赤色はクロロフィル、自家蛍光、および葉肉細胞を表している。

PFDでインキュベートすると葉が浸されたことは明らかですが、時折気泡が残る場合があります。これらの条件下では、水では葉に浸透しません。ここでは、細胞質に局在するYFPのバリアントであるVenusを発現させたopsysの葉を、空気、水、またはPFD中でインキュベートし、マウントしてレーザースキャニングを行いました。サンプルの共焦点顕微鏡観察の結果、PFDは空気や水よりも優れており、イメージングの深さが約2倍に向上することが示されました。

PFDと水を比較した場合、この手法を習得すれば、適切に行うことで5分から10分で完了させることができます。この手順を行う際は、perfluorodecalinがマニキュアやテフロンを溶解させますが、シリコングリスとは適合することに留意することが重要です。このビデオを視聴することで、植物の葉の細胞におけるイメージングを改善するための封入剤として、perfluorodecalinを使用する方法について十分に理解できるはずです。

per fluoro delinは無毒ですが、本手順を実施する際は標準的な安全基準に従うことを推奨します。