ポリメラーゼ連鎖反応：基本的なプロトコルプラスのトラブルシューティングと最適化戦略

本手順の全体的な目的は、少量の出発物質から特定のDNA断片を大量に増幅させるために用いられるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の一連の手順を実演することです。まず、PCR反応に使用する試薬と材料を準備し、次に4種類のデオキシリボヌクレオチド、DNAテンプレート、プライマー、およびDNAポリメラーゼを含む反応混合液を調製します。その後、サーマルサイクリング条件をプログラムし、PCR反応を実行します。

この後、結果を確認し、反応が成功したかどうかを判断します。最終的に、ポリメラーゼ連鎖反応によって、目的の産物サイズの特異的なアンプリコンが得られるはずです。

一般的に、このプロトコルを初めて行う方は、各可変試薬の計算設定に多少苦労することがあります。また、ピペッティングや正確な分注量、特にグリセロールを含むポリメラーゼの取り扱いに困難が生じる場合があります。実験は、氷を新しく満たしたアイスバケットを用意して開始してください。反応液のコンタミネーションを防ぐため、必ず手袋を着用してください。

混合液および試薬。PCRコンポーネントを氷上に配置し、完全に解凍させます。これらには、DNAテンプレート、プライマー、DNAポリメラーゼ、塩化マグネシウムを含むまたは含まない10 x 反応バッファー、デオキシヌクレオチド、滅菌水、および塩化マグネシウムが含まれます。

塩化マグネシウムを含まないバッファーを使用する場合は、塩化マグネシウムが必要です。0.2 mLの薄壁PCRチューブを保持するために、96ウェルプレートをアイスバケットに入れます。次に、ワークベンチにPCRチューブとキャップを用意します。

PCRチューブラック、エタノール耐性マーカー、およびマイクロピペットセット。常に、最終容量を50 µLにするために滅菌蒸留水を用いた反応混合物の試薬表を作成してください。例えば、マグネシウム不含バッファーを5 µL、10 mM dNTPsを1 µL、および最適化された4.0 mM マグネシウムを使用します。

20 µMの各プライマーを1 µL、2 ng/µLのテンプレートを0.5 µL、そしてポリメラーゼを0.5 µL加え、残りの33 µLを滅菌水で満たします。10xバッファーに含まれていない場合や、PCRの最適化に必要な場合は、塩化マグネシウムを添加してください。

エタノール耐性マーカーを用いて、各反応チューブにPCRチューブのラベルを貼ります。まず、計算した量の滅菌水を加え、次に10 x bufferと10 millimolar DN NTPsを加えます。この反応では、塩化マグネシウムを用いたタイトレーションを行います。

マグネシウム濃度が一定ではないため、塩化マグネシウムを個々のPCRチューブに添加し、滅菌水で10 µLに定容します。これにより、最終的なマスターミックス40 µLを各PCRチューブに添加することになります。50 µLの反応液量および塩化マグネシウム量を完結させるため、続いてDNAテンプレートとプライマーを添加します。最後に、1.8 mLマイクロ遠心チューブを用いて、50 µLの反応あたり0.5〜2.5 unitのDNAポリメラーゼを添加します。

コントロールおよびピペッティング時の損失分を考慮した十分な量のマスターミックス溶液を調製します。マイクロピペットを全溶液量の約半分に設定し、ピペッティングして穏やかに混合します。各テストサンプルに対し、マスターミックスをPCRチューブに分注します。

次に、鋳型DNAを含まないネガティブコントロールとして、すべての試薬を添加し、不足しているDNA量分を滅菌水で補います。続いてポジティブコントロールとして、実験用PCRサンプルと同じ条件下で既知の断片を増幅させる鋳型DNAとプライマーのセットを使用します。PCRサーマルサイクラーにより反応液が急速に加熱および冷却されることで、二本鎖の熱変性、DNA鋳型のプラス鎖およびマイナス鎖へのプライマーのアニーリング、そしてPCR産物の伸長が行われます。

サイクル時間は、テンプレートのサイズおよびDNAのGC含有量に基づいた一般式に従って設定します。まずテンプレートの初期変性を行い、次に3ステップの温度サイクルプログラムを25〜35回繰り返します。これらのサイクルの第1ステップでは、DNAテンプレートを変性させます。

次に、プライマーのアニーリング温度をプライマーの予測融解温度より約5°C低く設定し、続いてポリメラーゼをDNAテンプレートに結合させPCR産物を合成する伸長ステップをプログラムします。ここでサイクル数を入力してください。次にプログラムします。

アンプリコンの合成を完了させるため、伸長ステップを延長します。最後に、混合液を4°Cまで冷却する停止ステップを設けます。標準的なPCR条件で目的のアンプリコンが得られない場合は、より良い結果を得るためにPCRの最適化が必要です。

したがって、初回に反応が進まなかった場合は、反応のトラブルシューティングを試みる必要があります。まず、問題がヒューマンエラーによるものでないかを確認してください。これは、ピペッティングのミスや、試験管への試薬の添加忘れなどが原因で起こる可能性があります。

次に、条件の厳密性をいくつか変更してサーモサイクラーの設定を調整するか、あるいは別の方法としてマグネシウム濃度を変更することを検討してください。また、問題解決のために試薬に添加剤を加えることも有効です。あるいは、初期変性時間を大幅に延長する汎用性の高い修正方法として、ホットスタートPCRを検討してください。

次に、AROSゲル電気泳動を用いて、S seiaのゲノムDNAからGAL three遺伝子をPCR増幅し、この試薬セットにおける最適なマグネシウムイオン濃度を決定します。注意点として、期待されるサイズである2098 base pairsのPCR産物は、マグネシウム濃度2.5 millimolarから現れ始め、4 millimolarで最適となります。異なるDNAテンプレートを用いて目的のPCR産物を単一のバンドとして増幅させるには、2 millimolarのマグネシウムが必要です。反応の厳格さを下げて実質的に不十分な増幅条件にすると、非特異的産物のスメアが生じます。

さらに、反応の全体的な厳密性を下げることで、アンプリコンを形成するために必要なマグネシウムイオン量を少なくすることができます。したがって、各変数を考慮してPCRを最適化することで、目的の単一産物を得ることが可能です。このビデオを視聴することで、ポリメラーゼ連鎖反応のセットアップと準備方法について十分に理解できたはずです。

目的は、各PCRの変数を理解し、目的のアンプリコンを作成するためにそれらをどのように操作できるかを把握することです。