多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング

本実験の全体的な目的は、実験動物における外来性感染剤に対する抗体を検出することです。これは、被験血清を抗原コーティングされたマイクロスフィアとともにインキュベートすることで達成されます。次に、血清をビオチン化された種特異的抗免疫グロブリンとともにインキュベートし、抗原抗体免疫複合体を検出します。

その後、ストレプトアビジン標識FICO eryn Fluor force溶液を添加し、ビオチン化免疫グロブリンを検出します。これにより、マルチプレックス蛍光、イムノアッセイネットスコア、蛍光サンプル値に基づいた、実験動物（齧歯類）における一般的病原体の抗体陽性または陰性の判定結果が得られます。ELISAなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、MFIAがマルチプレックスアッセイであることです。これにより、研究者は1回の検査で最大100種類の異なるアッセイをスクリーニングすることが可能になります。

この手法は、従来の方法で必要とされていた血清領域の量や使い捨て廃棄物の量を削減しつつ、1回の手試験から得られる情報量を増加させることができます。私たちは、多数の血清検体を用いて複数の抗原を検査していた際、労力と検査時間の両方を削減したいと考え、この方法を使用することを思いつきました。ここからは、当研究室のシニアテクノロジストであるDonna Cohenが手順を実演します。まず、マルチプレックス蛍光免疫測定法（MFIA）の手順に必要な2種類のバッファーを用意してください。

1つ目は一次希釈液であり、Charles River社から入手可能で、アッセイ洗浄バッファーの非特異的な相互作用を減少させるための独自のブロッキング剤が含まれています。粒子を除去するため、1%BSAを含むpH 7.4のPBS溶液を調製します。アッセイ洗浄バッファーを用いて、このバッファーを0.2 micronのボトルトップフィルターでろ過し、ラベルを貼った滅菌容器に回収します。

テスト血清のインキュベーションステップで形成される抗原抗体複合体を標識するために使用する、ビオチン化抗種抗体（IgGまたはIgA）、ストレプトアビジン、およびフィコエリトリン（PE）の2倍濃度溶液を調製します。あわせて、マルチチャンネルおよびシングルチャンネルマイクロピペットとチップ、およびタンパク質希釈用の96ウェル低タンパク吸着マイクロタイタープレートなどの材料および消耗品を準備してください。血液サンプルを採取し血清を分離した後、血清を短時間ボルテックスし、96ウェルマイクロタイタープレート内で一次希釈液を用いてサンプルを希釈します。これにより、ウェルへの適切な均一な分注を確実に行います。アッセイ洗浄バッファーを用いて96ウェルテストプレートのすべてのウェルを事前に濡らし、アッセイ全体を通して溶液をゆっくりと吸引してください。

ビーズの凝集やフィルターメンブレンへのビーズの圧密を防ぐため、吸引は5〜10秒で行ってください。これらが起こると、アッセイ終了時の読み取り時間が遅くなる可能性があります。テストプレートの裏側をペーパータオルで吸い取り、液の排出が停止したことを確認してください。インキュベーション中にウェルから液が吸い上げられるのを防ぐため、洗浄ステップごとにテストプレートを吸い取ることが重要です。

ビーズを調製するには、まず結合済みビーズストック懸濁液をボルテックスします。次に、バスを用いて短時間超音波処理を行います。ビーズの凝集クラスターを防ぐために適切に再懸濁させることが極めて重要です。凝集が起こると、読み取り時間が長くなる可能性があります。

次に、20倍ストック懸濁液を一次希釈液で2倍ワーキングビーズ溶液に調製します。その後、2倍ビーズ懸濁液 50 µL を、あらかじめ濡らしておいたテストプレートの各アッセイウェルに分注します。あらかじめ定義したプレートマップに基づき、各2倍テスト血清およびコントロール血清 50 µL をテストプレートにピペッティングします。

プレートの蓋をしっかりと閉めます。溶液の蒸発はアッセイの失敗につながるため、アルミホイルで覆い、室温のオービタルシェーカーで60分間インキュベートします。すべてのインキュベーション工程において、テストプレートは蓋をしたまま保持してください。

さらに、ビーズが懸濁状態に保たれ、血清抗体が結合抗原の全表面にアクセスできるように、振盪速度は400 RPM超、700 RPM未満に設定してください。BAGおよびSPEを用いてビーズを順次インキュベートしてプレートを洗浄した後、サンプルを再度洗浄します。次に、125 µLのアッセイ洗浄バッファーを加えてビーズを再懸濁し、2分間振盪してからプレートを読み取ります。

ビーズを再懸濁させてから10分以内にアッセイリーダーにセットします。ビーズは検出器を1つずつ通過し、そこで2本のレーザーに照射されます。一方のレーザーはビーズの色セットを識別するための内部染料を励起し、もう一方はFICO erythingレポーター染料を励起します。あらかじめ設定された数のビーズにおけるFICO erything蛍光強度がFM FIとして報告されます。まず最初のウェルを読み取り、選択したビーズパネルがテストウェルのビーズプロファイルと一致していることを確認してください。

プロトコルディスプレイ上の指定されたビーズ領域外にビーズが落下している場合は、プロファイルの選択が間違っています。適切に再懸濁されたビーズは、アッセイリーダーソフトウェアで示される指定領域を満たします。ビーズが凝集している場合は、領域を充填する速度が遅くなります。

テストプレートをリーダーから取り出し、手動でウェルを再懸濁してビーズを分散させることができます。テストプレートをリーダーから取り出し、マルチチャンネルピペッターを用いて各ウェルを3〜4回トリチュレートします。その後、テストプレートをリーダーに戻し、結果の確認を継続します。

ビーズ数の不足や、IgG anti IgGビーズスコアの低下などのエラーを報告し、これらのサンプルのアッセイを繰り返してください。データをExcelにエクスポートして正味のMFIを算出した後、高レンジ免疫血清を除くテストプレイアッセイコントロールに不合格がないかを確認します。コントロールに不合格がある場合は不適格となり、アッセイを繰り返す必要があります。

この表は、典型的なアッセイプレートにおけるテスト血清およびアッセイコントロールのデータを示しています。すべてのIgGコントロールは合格しました。このプレートのテスト結果では、オレンジ色のウェルで示されているように、多数の組織反応性サンプルおよびIgGコントロールサンプルが不合格となったことがわかります。

A1C 1およびF1はTC組織反応性の不合格を示しており、かっこ内にTCスコアが表示されています。Wells B 1およびE 1は、それぞれBAGまたはSPEといった、テスト抗体またはテスト試薬の不足による2種類のIgG内部コントロール不合格の例を示しています。テストプレートの結果は、システム適合性コントロールおよび血清コントロールがここに示す判定基準を満たした場合にのみ解釈されます。種特異的な抗テスト血清免疫グロブリンでコーティングされたマイクロスフェアは、サンプル量の不足、過剰なサンプル希釈、不適切な種の使用、または免疫不全のホストからのテスト血清の添加により、不合格スコアを示すことがあります。

テストプレイアッセイのコントロール結果が良好であれば、個々のアッセイスコアを以下に従って分類します。この手順の後、初期の予期しない結果または陽性結果を確認するために、ELISA、IFA、および/またはウェスタンブロットなどの追加手法を用いる必要があります。動物の管理に関する決定を下す前に、これらの結果を検証することが極めて重要です。

これは、同一のサンプル、または同一のコロニーから得られた追加のサンプルに対して異なる手法を用いることで実施可能です。このビデオを視聴することで、マルチプレックス蛍光定量免疫測定法の実施方法と、貴施設で得られた結果の解釈方法について十分に理解できるはずです。これにより、各テストサンプルウェルからより多くの情報を収集しつつ、労力を削減することが可能になります。