神経、地帯、および蛍光色素で脊髄根の逆行ローディング

本手順の総合的な目的は、シンプルで低コストな手法を用いて、ニューロンまたは任意の神経路に高濃度の蛍光染料またはイオン感受性染料を導入することです。これは、まずタイプ1とタイプ2の2種類のピペットを作製することで達成されます。次に、タイプ1のピペットに柔軟なエラストマーチューブを接続し、正圧をかけて標的となる神経路をタイプ1のピペット内に吸い込み、良好なシールが形成されていることを確認します。

次に、タイプ1ピペットの中にタイプ2ピペットを挿入し、タイプ2ピペットを用いてタイプ1ピペット内の残ったA CSFを吸引します。その後、気泡が入らないように注意しながら、染料をタイプ1ピペットに導入します。最後のステップとして、ニューロンを暗所で6〜20時間インキュベートします。

最終的に、タイプ1ピペットを取り除いた後、調製物はin vitro、電気生理学的、または形態学的研究に使用可能な状態となります。バスアプリケーション、BOS注入、エレクトロポレーションなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、Dを特定のニューロン集団に送達できる点にあります。この手法は、特定のニューロンの活動、接続性、形態、および分布といった、神経科学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。

一般的に、この手法には習熟が必要です。特に、タイプ1ピペット内で染料が希釈されないようにすることと、内部に気泡が入らないようにすることに注意してください。まず、アルコールランプの炎でポリエチレンチューブを加熱・延伸し、先端が細くなった2本の短いピペットを作成します。最初に、標的となる根や道管をしっかりと保持できる、先端の小さい短いタイプ1ピペットを作成してください。

次に、タイプ1のピペットの先端まで挿入できる、より細長くシャフトが細いタイプ2のピペットを準備します。その後、タイプ2のピペットを19ゲージのECクリップ針に接続します。そして、単離した脊髄をバスに入れます。

ローディングプロセス全体を通して、冷却したA CSFで超融合させます。その後、タイプ1ピペットを電極ホルダーに設置し、背面開口部がフレキシブルチューブを介してシリンジに容易に接続できるようにします。この手順では、まずシリンジを用いてタイプ1ピペットにCSFを吸い込みます。

次に、充填する軸索路または根を描きます。その後、背面開口部からフレキシブルチューブを取り除きます。続いて、タイプ2ピペットを別のシリンジに取り付けます。

それをタイプ1ピペットに挿入します。このピペットは、顕微鏡下で軸索路または神経根を保持しています。タイプ2ピペットに取り付けたシリンジを使用してA CSFを吸引し、残ったA CSFが軸索路をちょうど覆うようにします。その後、タイプ1ピペットからタイプ2ピペットを抜き取ります。

軸索路または神経のシールが良好であることを確認するため、A CSFレベルを数分間モニタリングします。その後、色素をA CSFまたは二回蒸留水で調製した0.2%Triton X 100に溶解させます。気泡が混入しないように注意しながら、接続されたシリンジで弱い陰圧をかけて、タイプ2ピペットに色素を吸い込みます。

次に、色素の入ったタイプ2ピペットを、タイプ1ピペット内に残っているA CSF溶液に挿入します。シリンジに緩やかな正圧をかけながら、色素をA CSF中にゆっくりと放出させます。この際、気泡を混入させたり、チップ内部の標的組織を移動させたりしないように注意してください。色素の注入中にタイプ1ピペット内に気泡が混入した場合は、タイプ2ピペットの先端を気泡の近くまで進め、付属のシリンジを用いて緩やかな負圧をかけることで気泡を吸い出します。

十分な量の色素が放出された後、タイプ2ピペットを回収します。次に、実験の種類に応じて、組織を暗所で6〜20時間インキュベートします。充填に十分な時間をかけた後、組織から電極をゆっくりと引き抜きます。

これで、組織はイメージングまたは組織学的解析に使用できる状態になります。ここでは、3種類の異なるコンジュゲート蛍光色素を、運動ニューロン、感覚求心性ニューロン、および脊髄介在ニューロンに同時に注入する方法を示す概略図を示します。運動ニューロンと仙髄感覚求心性ニューロンには、それぞれ腹根および背根を通じて Cascade blue Dextran と Texas red dextran を逆行性に注入しました。また、腹側索を介して上行する軸索を持つ脊髄介在ニューロンには、緑色蛍光dextranを注入しました。

ここでは、ニューロンを逆行性に標識した仙髄切片の共焦点画像を示します。標識された感覚求心路は、主に同側に存在することに注目してください。少数の対側投射があるものの、標識された運動ニューロンは充填された腹根と同側にあり、一方で標識されたインターニューロンは、矢印で示されているように腹根と対側にあります。

この手順に従い、DI領域のニューロンにおける機能的結合性、興奮性・抑制性、洞型、分布、および神経伝達物質の産生といった重要な疑問に答えるために、追加の手法を実施することができます。この技術は、脊髄および脳幹の神経生理学分野の研究者が、イオン感受性色素を用いて特定のニューロン集団を抽出することを可能にしました。このビデオを視聴することで、単離脊髄のニューロンおよび感覚繊維に蛍光色素またはイオン感受性色素を適用する方法について、十分に理解できるはずです。