アゾキシメタン（AOM）とデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）によるモデリング大腸炎関連癌

0日目に、Myerはアゾキシメタンを注射し、翌週にOMを投与しました。その後、飲用水をデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）含有溶液に交換しました。3週目に、マウスに2週間、水を給与しました。

このDSS水サイクルをさらに2回繰り返します。2回目のDSSサイクルの後、鏡視下内視鏡を用いてマウスの腫瘍を確認できます。

10週後、マウスを安楽死させ、結腸を採取します。結腸を洗浄し、縦方向に切開します。その後、結腸の腫瘍径および腫瘍数を評価します。

結腸の縦断切片を3等分して包埋し、組織学的解析に供することができます。光学顕微鏡を用いて、腫瘍の計数および分類が可能です。本ビデオでは、遺伝毒性物質であるOMを投与し、続いて炎症促進剤を3サイクル投与するプロトコルを実演します。

DSSは、ヒトの大腸炎関連癌に見られるものと形態学的および分子的に類似した結腸腫瘍を、マウスにおいて迅速かつ一貫して誘発します。0日目に、尾へのマーキングまたは耳標を用いて個々のマウスを識別し、各マウスのベースライン体重をテーブルに記録します。次に、各マウスに10 mg/kgのOM溶液を注射します。OMは遺伝毒性物質であるため、取り扱いに注意してください。7日目に、その後1週間、飲料水として2.5% DSS溶液を供給します。この溶液を調製するには、蒸留水にDSS粉末を加え、溶解するまで混合します。

溶液を0.2 micronのセルロースアセテートフィルターでろ過すれば準備完了です。DSS溶液を7日間継続的に供給します。DSSは2〜3日ごとに交換してください。

この期間の後、ケージを水に戻して2週間飼育します。マウスの体重測定を週に2〜3回行い、直腸出血や下痢がないか観察してください。腫瘍が大きいマウスでは、一時的に直腸脱が生じることがありますが、通常、生存率への影響はありません。

ベースラインからの体重減少を、大腸炎の重症度の代替指標として用います。DSS投与の1サイクル後、1週間以内に、2〜3日間の下痢および血便を伴い、最大10%の体重減少が見込まれます。屠殺前にin vivoで腫瘍の成長を確認するため、DSSの2回目または3回目のサイクルを行うことができます。

A-O-M-D-S-Sモデルは腫瘍の形成率が非常に高いため、通常このステップは不要です。この方法はマウスの腫瘍を損なう可能性があるため、少数のマウスのみを評価対象とするべきです。作業エリアには、滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を入れたビーカーと、空のビーカーを用意してください。

使用済みのPBSを廃棄するには、8〜10 mLのPBSをシリンジに吸い上げ、使用ごとに内視鏡の末端に取り付けます。管腔内の内容物をフラッシングする際は、吸入または注射による鎮静で各マウスを麻酔し、テープを用いてマウスを平らなボードに固定します。尾と胸部を固定し、マウスの足底を挟んで保持します。十分な鎮静が行われているか確認するため、親指と人差し指でマウスの下腹部をつまんで肛門を露出させ、muren内視鏡をマウスの直腸内に挿入します。

PBSを用いて緩やかに拡張および洗浄を行い、管腔内の視認性を高め、糞便内容物を除去します。モニターで観察しながら、内視鏡をゆっくりと進め続けます。70日目において、A-O-M-D-S-S処理を施した各マウスには複数の結腸腫瘍が認められ、評価可能な状態であるはずです。

より大きな腫瘍を得たい場合は、この状態まで数週間から数ヶ月遅らせることができます。ガバージュ針を装着し、PBSを満たしたシリンジを用意します。10% formalinを充填したシリンジ、外科用基本ハサミ、およびラウンドチップハサミを用意します。

1% Evans Blue溶液を充填した小型シリンジと精細鉗子を用意します。また、冷却トレイ、冷却したPBSAを入れたウェルボート、切片作成用の新しいカミソリ、および10%ホルマリンを満たした固定槽を配置します。イソフルラン投与と頸脱臼、またはその他の施設認定の方法により、各マウスを安楽死させます。最終体重およびその他の測定を行うことができます。

この時点で、マウスの腹側を上にして解剖台に置きます。腹部に70%ethanolをスプレーし、被毛が解剖領域に入らないようにします。ピンセットで腹部正中線を掴み、皮膚を小さく切開して腹膜を露出させます。

緩やかな牽引を用いて皮膚を腹膜から剥離し、腹腔全体を露出させます。腹膜を切開し、この切開線を両側の肋骨縁に沿って延長します。閉じた状態でハサミを用い、小腸と結腸を脇へよけます。

これにより腸間膜リンパ節が露出し、必要に応じて採取することが可能です。評価を行う際は、泌尿生殖器系を下方へ掃去して下行結腸と直腸を露出させ、骨盤をさらに露出させるために必要に応じて膀胱と生殖器を切除します。その際、隣接する組織を損傷しないよう注意してください。

恥骨下枝および恥骨上枝を切断し、肛門直腸移行部を露出させます。緩やかに上方へ牽引しながら、肛門直腸移行部周囲の皮膚を切開して結腸を遊離させます。腸間膜鉗子を用いて、結腸の付着部を切除または剥離します。

肛門直腸 junction 部の皮膚の一部を保持することが重要です。この領域は異形成の影響を受けやすいためです。盲腸の直近で大腸を小腸から切断します。5 mL シリンジに取り付けた 18ゲージのゾンデ針を用いて、盲腸を隣接する結腸から分離します。

丸みを帯びた先端の剪刀を用い、生理的な方向に液体が流出するように、結腸を氷冷したPBSで洗浄します。腸間膜に沿って結腸を切開して開きます。開いた結腸を冷却トレイの上に広げます。

組織が凍結しないよう、トレイが十分に解凍されていることを確認してください。腫瘍をより明確に視認するため、1% Ian Blueを指で数滴塗布します。定規を用いて腫瘍の数とサイズを評価するか、デジタル解析用に写真を撮影します。

この時点で、RNA、タンパク質、または免疫組織化学的手法による今後の解析のために、隣接する正常組織を含む腫瘍の小さな切片を切り出し、組織学的評価用に大腸の一部を残しておきます。シリンジまたは指を用いて、コールドトレイ上の残りの大腸に10% formalinを塗布し、少なくとも30秒間組織を固定させます。これにより、固定槽への移送が容易になります。

同じトレイ上の別の開大結腸を染色する前に、残留したホルマリンを拭き取ってください。結腸を10%ホルマリンを満たした容器に移し、端をピンで固定します。3時間の固定後、ホルマリンを廃棄し、70%エタノールに交換します。

結腸は70% ethanolで無期限に保存可能です。弱熱を用いて2% agar溶液を調製し、ガラスプレート上に清潔なスライドグラスを用意します。固定した結腸を3等分に切断し、使用しない部分はethanolベースに戻します。

2枚のカミソリを使用して、各切片を均一な大きさに切り揃えます。結腸の切片および層を、清潔なスライド上のアガーに埋め込みます。次の結腸についても、この手順を繰り返します。

セグメントを切り出し、余分なアガーを除去し、埋め込まれた結腸をカセットに入れ、ヘマチン・エジンによる処理および染色の工程に進めます。図1に、潰瘍性大腸炎関連がん誘導のプロトコルを示します。図2は、OMおよびDSS投与中のベースラインに対するマウス体重の変化を示しています。

各DSSサイクル後の1週間で、マウスの体重が5～10%減少することに注意してください。本実験における体重減少は、大腸炎の重症度の代替マーカーとなります。図3は、A-O-M-D-S-S投与50日目における、マウス内視鏡による遠位結腸の腫瘍の様子を示しています。

パネルBおよびCにおいて、正常な結腸と比較して遠位結腸の管腔を閉塞している複数のポリープ状腫瘤に注目してください。図4のパネルAは、縦方向に切開したマウス結腸を示しており、腫瘍の肉眼的外観が示されています。遠位結腸で腫瘍負荷が高くなっていること、および腫瘍の成長がほとんど見られない近位結腸の特有の質感に注目してください。

図5は、lcおよびブルー染色の適用によって強調された腫瘍を示しています。染料が結腸の正常な組織構造だけでなく、個々の腫瘍の境界をも強調していることに注目してください。このような染色は、定規やデジタル計測による腫瘍面積の精密な測定に有用です。

図6は、OMおよびDSSで処理したマウス1匹あたりの平均腫瘍数の代表的な分布を示しています。大部分の腫瘍は遠位結腸に位置し、サイズは2 mm未満であることに注目してください。図7は、カセットに入った結腸のパラフィン包埋縦断切片と、H&E染色スライドを示しています。

残留するSおよびブルー染色がH&E染色を妨げないことに注意してください。スライド画像では、大きな腫瘍が円で囲まれています。遠位、中位、近位という指定は、盲腸から肛門まで結腸全体を3等分に切除した結果に基づいています。

図8は、遠位結腸においてOMおよびDSSを投与して生じた腫瘍の代表的な組織像を示しています。提示された顕微鏡写真はH&E、BrdU、およびβ-cateninで染色されており、ヒトの結腸腺がん様の異形成変化が認められます。本ビデオでは、OMの単回投与に続き、DSSを7日間で1サイクルとして3サイクル投与することで、炎症誘発性のマウス結腸腫瘍形成を誘導するプロトコルを実演しました。

このモデルでは、10週間にわたって、ヒトの潰瘍性大腸炎関連癌で起こるものと組織学的および分子的に酷似した変化を伴う腫瘍が誘導されます。これにより、本疾患における腫瘍発生および化学予防の研究において非常に価値の高いモデルとなります。