官能ビス - ペプチドの固相合成方法を "安全キャッチ"を使用して

本実験の目的は、固相法を用いて機能化BSPペプチドを合成することです。まず、保護されたBISアミノ酸をヒドロキシエチル安息香酸樹脂に担持させます。その後、機能化されたbisアミノ酸を結合させるための保護・カップリングサイクルを繰り返すことで、BISペプチドを伸長させ、目的の機能性を付与します。

最後に、DI Keto pyrazine形成によって樹脂からBISペプチドを切断するため、最初のビスアミノ酸をαアミノ酸で修飾します。液体クロマトグラフィー質量分析による解析の結果、機能化されたBSPペプチドが良好な粗純度で合成され、約10%の安定した単離収率が得られることが示されました。BISペプチドは固体樹脂上で構築されるため、溶液中での反応よりも操作が容易であり、副生成物もろ過によって簡単に除去できることから、本手法はビスペプチドのパラレル合成やライブラリ合成への応用が期待されます。

多くのステップにおいて、すべての反応を可能な限り完結させるために必要な重要な詳細事項が多くあり、習得が困難であるため、本手法を視覚的に実演することが不可欠です。固相合成では、中間体を精製する方法がありません。したがって、純度の高い最終生成物を得るためには、すべての反応を最大限まで進行させる必要があります。

手順が反復的な性質を持つため、混乱を避けるために実験手順のチェックリストを作成することを推奨します。このプロトコルは、最初のBSPペプチドのロード、最初のBSPペプチドの保護、および同時に行われるレジンキャッピングから始まります。まず、114 mgのH-M-B-A-Aレジンを8 mLの反応容器に量り取り、マグネチックスターラーを追加して、最初のBSPペプチドをロードします。

容器の上部をゴムセプタムで封止し、アルゴンで少なくとも5分間パージします。その間に、記述プロトコルに従って活性化BISアミノ酸溶液を調製します。このビデオに付随して、溶液をシリンジで反応容器に移し、アルゴン雰囲気下で一晩撹拌します。翌日、セプタムを取り除き、反応混合物を排出します。

約2 mLのクロロメタンを樹脂に加え、樹脂を洗浄します。30秒から1分間撹拌した後、液を排します。この工程をDCMで4回繰り返し、その後、ジメチルホルムアミドで樹脂を5回洗浄します。

1番目のビスアミノ酸の脱保護と同時にレジンのキャッピングを行うため、酢酸およびDCM中33%臭化水素酸溶液2 mLを反応容器にゆっくりと加えます。DCMでレジンを5回洗浄し、排液した後、15分間攪拌します。この脱保護の手順をもう一度繰り返します。

次に、樹脂をDCMで5回、続いてDMFで5回洗浄し、DMF中5%（v/v）のD-I-P-E-A溶液で2回洗浄して樹脂を中和します。その後、再びDCMで5回、DMFで5回洗浄します。これで、保護された機能化ビスアミノ酸のカップリングを行うことができます。

まず、脱水DCMで3回洗浄し、樹脂を含む反応容器内に不活性雰囲気を再導入します。次に、セプタムとアルゴンラインを装着し、脱水DCMを1～2 mL加えて30秒間撹拌し、容器内を洗浄します。その後、アルゴンラインのバブラーが上がり始めるまで容器内を排出します。

この工程を少なくともあと1回繰り返します。次に、アルゴン雰囲気下で、火炎滅菌した試験管を用いて官能基化ビスアミノ酸溶液を調製します。47 µLのDICを加え、90分間撹拌します。

次に、35 µLのD-I-P-E-Aを666 µLの無水DMFに加え、樹脂に加えてさらに5分間撹拌します。あらかじめ活性化したBISアミノ酸溶液をシリンジで容器に移し、翌日まで一晩撹拌します。反応混合物を排出し、アルゴン雰囲気下で無水DCMを用いて2回洗浄します。

本手順における重要なステップは、ビスアミノ酸のカップリングです。ジケトピペラジン環の閉環を確実にするため、活性化剤を追加し、反応時間を長く設定します。ジケトピペラジンの閉環を促進するため、HOATおよびDIC溶液を加え、アルゴン雰囲気下で1時間撹拌します。

次に、セプタムを取り除き、反応混合物を排出します。レジンをDCMで5回、DMFで5回洗浄します。このセクションでは、機能化されたBISアミノ酸の深部保護、Fmocの深部保護、および最初のBISアミノ酸のアシル化について説明します。

保護された機能化ビスアミノ酸の深層保護を行うため、TFAとTIPSの混合溶液2 mLを反応容器にゆっくりと加え、1時間攪拌します。液を排出した後、DCMで約30秒間樹脂を洗浄し、その後液を排出します。このDCM洗浄を5回繰り返します。次に、A-D-C-M-D-M-F洗浄に従い、樹脂洗浄の全シーケンスを繰り返します。DMF中5%（体積比）のD-I-P-E-A溶液で2回洗浄し、樹脂を中和します。

次に、再度D-C-M-D-M-Fで洗浄します。ここから、BISペプチドを他の機能化されたビスアミノ酸で伸長させるか、先端の窒素カルボン酸を機能化させるか、あるいはその両方を行うことができます。FM基を脱保護するために、20%ピペリジン/DMF溶液2 mLを加え、20分間混合します。

DMFでレジンを5回洗浄し、液を捨てます。さらにレジンを洗浄した後、この工程をもう一度繰り返します。最終ステップとして、調製したアミノ酸溶液を反応容器に加え、6時間撹拌して、最初のアミノ酸二量体を単離します。

樹脂をDCMで5回、次いでDMFで5回洗浄します。本プロトコルの最終工程では、樹脂結合アミノ酸からのBach基の除去と樹脂からの切り出しを行います。まず、1:1のTFA-DCM溶液2 mLを反応容器に加え、30分間撹拌します。

レジンをDCMで5回洗浄し、液を落とします。その後、この工程をもう一度繰り返します。DCMで5回、次にDMFで5回、それぞれ30秒間洗浄し、液を落とします。

次に、10% D-I-P-E-Aの無水DMF溶液を2 mL加え、24～48時間撹拌します。最後に、反応混合物をあらかじめ重量を量っておいた丸底フラスコに回収します。この溶液30 µLをLC-MSバイアル内の450 µLのテトラヒドロフランに転移させ、分析に提出します。

樹脂をさらに少量のDMFで洗浄し、丸底フラスコに回収します。合成全体を通じて樹脂上の化学変換をモニタリングするために、以下の方法を用いることができます。遊離水酸基を検出するには、まず使い捨てピペットで約1 mgの乾燥樹脂を取り出し、メチルレッド試験を行います。

4 mLの反応容器に移して洗浄します。本文の記載に従って調製したメチルレッド溶液を加え、5～10分間攪拌します。樹脂をろ過し、DCMで5回洗浄します。オレンジ色または赤色の樹脂ビーズは、遊離ヒドロキシ基の存在を示しています。

この試験は、最初のビスアミノ酸の負荷およびレジンのキャッピング工程を評価するために使用できます。二次的な手段で検出するには、使い捨てピペットを用いて約1 mgの乾燥レジンを小型バイアルに移し、クロラール試験を行います。そこに0.8 mMのDMF溶液中のクロラールと2%酸アルデヒドのDMF溶液をそれぞれ3滴ずつ加えます。

室温で5～10分間静置します。この場合、樹脂ビーズが青色または紫色になることは、樹脂結合化合物上に遊離の二次アミンが存在していることを示しています。活性化効率を確認するために、活性化トラップ試験を行います。合成中の活性化化合物は、活性化溶液5～10 µLを、50 µLのolaineを含む液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）バイアルに移し、手で混合することで評価できます。

数秒後、溶液が黄色に変化します。その後、450 µLのテトラヒドロフランで希釈し、LC-MS分析に供します。最終生成物および活性化中間体は、C18逆相カラムを備え、水および0.1%ギ酸含有アセトニトリルの溶媒系を用いたLC-MSシステムを用いて評価できます。このLC-MS-UVトレースは、粗生成物の純度が高いことを示す例です。

21.3分に検出されたスペクトルの主要ピークは、期待される生成物の質量と一致するマスクを持つことが判明しました。これは粗生成物の質量スペクトルで視覚化でき、当該の質量にナトリウムイオンの質量を加えたもの、およびIV DDE保護基の質量を引いたものに対応する主要ピークが示されています。ここでは、精製後のスペクトルのLCMS UVトレースにより、21.3分に非常に純度の高い生成物が得られていることが示されており、質量スペクトルによってこの精製されたピークの同一性が確認されています。

このビデオを視聴することで、開発後の機能化ビスペプチドを合成するための固相法に関する十分な理解を得ることができます。この手法を習得すれば、ビスペプチド分野の研究者がタンパク質-タンパク質相互作用や触媒における応用を探索する道が開かれます。適切に実施すれば、この手法によって機能化ビスペプチド三量体を4〜5日で合成することが可能です。

本手順を行う際は、ビーズを反応溶液および洗浄溶液に浸した状態に保つことが重要です。立体化学の影響や、タンパク質結合または触媒活性に対する異なる官能基の影響など、追加の疑問を解決するために、パラレル合成やライブラリー合成などの他の手法を実施することも可能です。有機試薬の取り扱いは極めて危険である場合があるため、本手順を行う際は、適切な個人用保護具の使用やドラフトチャンバーの利用など、常に十分な予防措置を講じてください。