タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

本プロトコルでは、ポリオウイルスとポリオウイルス認識ナノボディの相互作用を利用し、簡便な定量的な液相アフィニティーキャプチャーアッセイを実演します。原理的に、コバルトコート磁性ビーズを用いて、タグ付きタンパク質および相互作用する放射性標識タンパク質をプルダウンします。まず、標識タンパク質とタグ付きタンパク質を混合し、室温でインキュベートします。

次に、タグを認識する磁気ビーズを加え、磁石を用いてラベル化タンパク質の結合画分を非結合画分から分離します。その後、非結合画分に含まれるラベル化タンパク質のシグナルを測定し、非結合画分中のラベル化タンパク質量を決定します。この液相アフィニティーアッセイによる結果は、構造変化に敏感なタンパク質を解析する場合に非常に有用です。

この液相アフィニティキャプチャーアッセイは、ポリオウイルス認識ナノボディとさまざまなポリオウイルス抗原との間の相互作用に関する知見を提供できます。この手法は、一方のタンパク質を標識でき、もう一方のタンパク質を検出できるのであれば、他のタンパク質間相互作用にも適用可能です。我々は、ポリオウイルス認識ナノボディとさまざまなポリオウイルス抗原との相互作用の調査に関心を持った際に、この手法を考案しました。

ポリオウイルスは、固体表面に付着した際の構造変換に敏感であるため、e LSAの利用には制限があります。したがって、液相ベースのシステムが好まれます。ポリオウイルスの研究でよく用いられるこのような液相ベースのシステムの例として、micro proteinが挙げられます。

免疫沈降法によるアッセイです。この手法の適用性は証明されていますが、従来の抗体のような結晶構造が必要であり、ナノボディにはそれがありません。非常に安定しており、興味深い単一ドメイン抗体であるこれらのナノボディは、異なるテキストを用いて容易にエンジニアリングすることが可能です。

広く用いられているHisタグは、ニッケルやコバルトなどの二価イオンに親和性を示し、これらのイオンは磁気ビーズ上に容易にコーティングすることができます。そこで我々は、コバルトコーティング磁気ビーズを用いた簡便な定量的親和性捕捉アッセイを開発しました。

ボルテックスで磁気ビーズのストックを再懸濁し、各サンプルにつき10 µLをチューブに移して磁石を用いてビーズをペレット化します。洗浄のため、透明な上清を除去します。結合バッファーを150 µL加えます。

マグネットを用いてビーズを回収し、2回目の洗浄後、上清を除去します。各サンプルおよびコントロールについて、ビーズを40 µLの結合バッファーに再懸濁します。サンプル1のバックグラウンド用には、放射性標識ウイルスを含まず、同量の結合バッファーのみを入れたコントロールウェルを用意します。

100%の放射能サンプルを2つ用意します。ナノボディを結合バッファーに置き換えて、それ以外のすべての成分をウェルに加えます。次に、結合バッファーを用いて全量を80 µLとし、2000 cpmの${}^{35}\text{S}$標識ポリオウイルス7株1型をすべてのサンプルに加えます。

コントロールを承認します。サンプル1です。各サンプルに10 µLのナノボディ希釈液を添加します。

シェーカーで10秒間十分に混合し、室温で1時間インキュベートします。次に、洗浄済みの磁気ビーズ懸濁液を40 µL加え、連続的に振盪しながら室温で10分間インキュベートします。磁石でビーズをペレット化し、各サンプルの放射能を測定するために、上清をチューブに移します。上清50 µLを計数用フラスコに移します。3 mLのシンチレーション液混合物を加え、シンチレーションカウンターで測定します。

水を用いてチューブ内の使用済み磁気ビーズを回収し、500 ×gで2分間遠心分離します。上清を捨て、0.5 molar 水酸化ナトリウム 6 mLにビーズを再懸濁します。その後、懸濁液を複数のチューブに分注し、超音波洗浄機で5分間インキュベートします。

磁石でビーズをペレット化して上清を除去した後、各チューブに2% SDS溶液を1 mL加え、ボルテックスミキサーとフォイルで5分間混合します。次に、ビーズを回収します。各チューブに0.2 M EDTA（pH 7）を1 mL加え、超音波洗浄機で5分間インキュベートします。

その後、ビーズを回収し、1 mLの水で3回洗浄した後、1 mLの10 mM塩化コバルト溶液で洗浄します。チューブをシェーカーにかけ、10分間振盪します。次に、マグネットを用いてビーズを回収し、1 mLの結合バッファーに再懸濁します。

1 mLの20%エタノールで2回洗浄し、最後にビーズを元の量である20%エタノールに再懸濁して、濃度40 mg/mLの再生ビーズを得ます。コントロールを設定して、バックグラウンド放射能を補正します。コントロール試料1を0%放射能値、コントロール試料2を100%放射能値として設定します。

次に、各サンプルについて、ナノボディによる放射標識ウイルスの全体的な沈降の指標として、上清中の放射能の割合を算出します。本実験では、ポリオウイルスの3種類の異なる抗原（天然抗原、加熱抗原、14 sサブユニット）を用い、PVSS 38 Cとポリオウイルス特異的抗体の親和性を評価しています。興味深いことに、放射標識14 sサブユニットを含むサンプルの上清中の放射能は、ナノボディPVSS 38 Cの濃度上昇に伴って減少します。これは、ナノボディPVSS 38 Cに結合し、間接的に磁気ビーズに結合したポリオウイルス14 sサブユニットの量が増加したことを示しています。

pvs S 38 CはポリオウイルスのN抗原型およびH抗原型に対して親和性を示さないため、このナノボディはポリオウイルスの14 sサブユニットに特異的であると考えられます。本手法で測定したナノボディの抗原に対する親和性は、無関係なナノボディと比較して特異的です。NB oneは、ポリオウイルスの3つの抗原型のいずれに対しても反応性を示しません。

異なる日に異なる研究者が作成したこの用量反応曲線が示すように、本システムは高い再現性をもたらします。この信頼性の高い液相アフィニティーキャプチャーアッセイを習得すれば、ビーズのリサイクルを含め、2時間以内に適切に実施することが可能です。このビデオを視聴することで、異なるタンパク質間の相互作用を研究する際、特に固相ベースのシステムが使用できない場合に、磁性ビーズを用いた液相アフィニティーキャプチャーアッセイをどのように使用すればよいかについて、十分な理解が得られるはずです。