3DNAを有する核酸構造の分析と構築

この手順の全体的な目的は、最先端の計算ツールを用いてDNAおよびRNAの空間的な組織化を調査するために、3D NAプログラムスイートを研究者などの利用者に提供することです。まず、3D NAフォーラムからソフトウェアをダウンロードし、ローカルコンピューターにインストールします。次に、構成要素である塩基対ステップのレベルで、代表的なDNA構造を解析します。

次に、同一のDNA構造を塩基対ステップレベルで修正し、新たに定義した塩基対ステップパラメータを用いて再構築します。続いて、関連する構造の巨大なアンサンブルの解析を行います。最終ステップでは、構造のグローバルな歪みを可視化するため、一連の関連するDNA構造を共通の参照フレーム上にアライメントします。

最終的に、3D NAツールは、薬物やタンパク質が結合している箇所を含む個々の塩基対ステップが、DNA全体のフォールディングにどのように寄与しているかを調べ、大規模な全体的歪みの部位と方向を特定するために使用されます。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、ソフトウェアが堅牢であり、さまざまな種類の核酸含有構造に広く適用可能であることです。この手法は、ゲノムが三次元的にどのように組織化されているか、またDNAがどのような変形をとり得るかといった、生化学および生物物理学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

ソフトウェアパッケージのインストールを開始するには、three DAのウェブサイト（xthreed.org）に接続し、3D NAフォーラムへのリンクをクリックしてください。フォーラム内で「register（登録）」リンクを選択し、指示に従って新しいアカウントを作成します。

ユーザー名とパスワードを設定後、フォーラムにログインし、ウェルカムセクションにあるダウンロードリンクを選択して、新しいページで「3D NA download」を選択します。tar gzファイルをダブルクリックして、3D NAソフトウェアが含まれる「X 3D NA-V 2.1」という名前のフォルダを作成します。Macintoshでは通常ユーティリティにあるターミナルアプリケーションを開き、「X 3D NA-V 2.1」ディレクトリに移動します。

3D NAを適切に機能させるために必要なセットアップスクリプトを実行します。このビデオで使用されるすべてのコマンドは、テキストプロトコルで確認できます。次に、画面に表示される2行のエクスポート設定をコピーしてください。

ユーザーがソフトウェアをアプリケーションディレクトリに配置している場合、2つの行がここに示されているように表示されます。アプリケーションディレクトリにあるテキスト編集アプリケーションを開いてください。「フォーマット」メニューから「標準テキストにする」を選択します。

.bashrcファイルが存在する場合は、そのファイルをテキスト形式で開き、ファイルの末尾にエクスポート設定を編集して貼り付けます。bashrcファイルが存在しない場合は、空白のファイルにエクスポート設定を貼り付け、ホームディレクトリに.bashrcというファイル名で保存してください。新しい設定を有効にするには、ターミナルプログラム内で新しく保存した.bashrcファイルを実行してください。

このビデオでは、代表的な核酸構造である、細菌 Borrelia bergdorfii 由来の HBB タンパク質に結合した DNA の解析について実演します。3D NA 解析の最初のステップは、すべての塩基対をリスト化したファイルの作成です。これは、ファイル NP two, MP two pdb に保存されている原子構造に Find para プログラムを適用するコマンドを入力することで行います。

解析の次のステップでは、構造を特徴付ける幾何学的パラメータを決定します。analyzeコマンドに塩基対ファイルを入力すると、作業ディレクトリにいくつかの出力ファイルが作成されます。その後、analyze two MP two bpsと入力することで、幾何学的数値を算出できます。

生成される出力ファイルには、計算されたパラメータの概要を含む「MP two out」と、剛体パラメータのリストを含む「bpco step par」の2つが含まれます。核酸構造の解析に加え、3D NAソフトウェアでは、「rebuild」コマンドを使用して剛体パラメータから構造モデルを構築し、バックボーンと塩基原子の両方の座標を含む近似的な原子モデルを作成することが可能です。テキストに記載されているコマンドを入力してください。このコマンドは、剛体パラメータからのモデル構築において、標準的なB-DNAバックボーン配座を導入するように3D NAに指示するものです。

適切なコマンドを入力することで、H-B-B-D-N-A構造で見出された剛体パラメータを持つ二重らせんモデルを構築できます。bpco step par ファイルを編集することで、修飾された構造を生成できます。ここでは、最大曲げが生じている2つの部位における極端なロール角を修正します。

次に、修正したステップパラメータのセットを入力ファイルとして構造を構築します。単一の核酸含有構造の解析とは対照的に、2つのモデルを標準的な分子ビューアで表示させることができます。このビデオのセクションでは、MD_set1.pdbから始まり、末尾に番号が付いた一連のファイルに含まれる大量の構造アンサンブルを解析する方法について説明します。

解析の最初のステップは、前述のとおりfind pairプログラムを実行して得られる塩基対の同定である。すべての構造セットが同一の塩基対形成スキームを共有しているため、ここでは代表的なファイル（末尾が1001のファイル）に対して一度だけfind pairを実行すればよい。これにより塩基対の情報が生成され、ファイルMD at set one BPS PSに保存される。次のステップでは、Command X 3D ncore ensemble.Analyzeを使用して、構造セット全体の幾何学的パラメータを算出する。その後、概要出力ファイルMD at set one outから、目的の剛体パラメータを抽出することができる。

これはCommand X three DCO ensemble extractを用いて行われます。ロール角が抽出され、カンマ区切りのロール角のテキストファイルが作成されます。このファイルは、さらなる分析やプロットのために他のプログラムで読み込むことができます。

3D NAの最新バージョンには、共通の視点から複数の構造を観察できる新機能が搭載されています。X three DCO ensemble reorientコマンドは、以前のプロトコルと同様に、関連する構造の集合体を共通の塩基対または塩基対ステップに重ね合わせます。最初のステップは、find pairプログラムを用いてDNAの塩基対形成を計算することです。

この例では、入力ファイルとして、CIA coliの10個の構造を含む2つのKEK pdbファイル、およびLACリプレッサータンパク質のヘッドピースに結合したO 3D NAオペレーターを使用します。Command X three DCO ensemble reorientコマンドは、マルチモデル構造内の個々のモデルを共通の参照フレームに合わせて整列させます。このコマンドには、入力としてPDBファイルと前ステップのベースペアリングファイルの両方が必要です。

また、コマンドには、すべての構造の基準としてアライメントを行う塩基対ステップの同一性も含まれています。W 3D NAウェブインターフェースには、3D NAソフトウェアパッケージの主要な機能がいくつか含まれています。本ビデオのこのセクションでは、ウェブサーバーを用いてタンパク質が結合したDNAの三次元モデルを構築する機能について解説します。

タンパク質修飾DNAモデルを構築する最初のステップは、W 3D NAのウェブサイト（W three d.rutgers.edu）にアクセスすることです。ページ左上のメニューから「Selection of reconstruction」を選択すると、オンラインモデル構築機能が有効になります。次のステップは、新しく表示されたページの中央にある薄い色のボックス内の「bound protein DNA template」リンクを選択することです。

この選択を行うとプルダウンメニューが有効になり、ユーザーは結合タンパク質の数を指定できます。結合タンパク質の数を選択すると、新しい指定ページに移動します。そこで、ユーザーは希望する配列を入力または貼り付けることができます。

新ページの中心にあるテキストボックスの下に、DNAの非結合領域のらせん構造を選択するためのプルダウンメニューがあります。仕様ページの下部付近には、結合タンパク質の結合位置とファイル名を入力するためのテキストボックスがあります。結合位置では、DNA配列上のタンパク質結合断片の中心位置を指定します。

仕様ページの最下部に、タンパク質結合DNAのプレビューを生成するためのボックスがあります。ここでは、そのボックスにチェックを入れ、「continue」ボタンをクリックします。この操作により、選択したパラメータの一覧、および選択した結合部位の重複によって生じたエラーを表示する確認ページが生成されます。

変更が必要な場合は「戻る」ボタンを、次へ進む場合は「ビルド」ボタンを選択できます。次のページには、最も伸長した配置にあるDNAタンパク質複合体の静止画が表示され、ウェブ経由でオンラインのインタラクティブな視覚化が可能です。また、原子座標を含むファイルをダウンロードすることもできます。

3D NAソフトウェアツールは、核酸構造の解析に日常的に使用されています。剛体パラメータの値は、3次元構造における歪みを明らかにします。例えば、Borrelia Bergdorf RHBBタンパク質とのDNA結晶複合体において、ステップ13および22で見られる、大きな正のロール角を伴い主溝側へ極端に屈曲した2つの部位などが挙げられます。

これらの数値から構造を再構築できるソフトウェアの機能により、個々の塩基および塩基対ステップが分子全体の折り畳みにどのように寄与しているかを決定することが可能になります。ここで示されているように、HBBによって誘導されるDNAの全体的な曲がりは、上述した2つの極端な役割の歪み以上のものを反映しています。これらの塩基対ステップを直線化した状態で再構築しても、DNAは高度に湾曲したままとなります。

これは、ロールの最大値2つをゼロに設定した場合の状態です。3D NAにおける大量の関連構造を解析できるという新機能により、シミュレーションされたDNAおよびRNA分子の空間配置における、配列依存的および時間依存的なパターンの両方を抽出することが可能になります。例えば、2つの大規模なシミュレーションDNA構造セットにおける隣接する塩基対間のロール角を黄色で色付けすると、これらの分子がプリン塩基対ステップで優先的に湾曲していることがわかります。

DNAの両端で短期間持続する、赤色で示された高いロール値は、二重らせん構造の局所的な融解と再アニーリングを示唆しています。相補的塩基間の角度や距離などの他の剛体パラメータの変動パターンは、正確な構造歪みの解明に役立ちます。3D NAソフトウェアにより関連分子を共通の参照系で再配向できることで、プロテインデータバンクに保存されている多くのファイルに隠れていた全体構造の特徴が明らかになります。

例えば、対応する原子の二乗平均平方根偏差（RMSD）に基づいた関連構造の従来のアライメントでは、ここでは互いにほぼ重なり合う一連の類似した空間経路が生成されます。大腸菌（Escherichia coli）のO3 DNAオペレーターがLACリプレッサータンパク質のヘッドピースに結合した10個のNMRモデルにおいて、同一の構造を共通の座標系上の各二本鎖の5'末端塩基対に重ね合わせると、分子が著しく異なる方向に屈曲しており、全体構造に大幅な歪みがあることが明らかになります。この構造的な多様性は、大腸菌のLACリプレッサータンパク質がO3に結合し、LACオペロンにおけるO3と配列的に離れたオペレーターとの間にループを誘導する容易さに影響を与える可能性があります。ここに示されているように、Borrelia burgdorferi由来のH-NSのようなアーキテクチャタンパク質の正確な配置は、DNAの全体的な折り畳みに劇的な影響を及ぼす可能性があります。

既知の高解像度構造の2つのコピーが43塩基対で離れている場合、81塩基対のDNA断片は、密接でほぼ円形の構成へと閉じます。2つのタンパク質がさらに5塩基対分離している場合、DNAは開いた蛇行経路をたどります。タンパク質が装飾された二重鎖のこれら大きく異なる配置は、アーキテクチャタンパク質の間隔が、形成後のDNAの環化またはルーピングにどのように影響し得るかを示しています。

この技術は、核酸構造生物学分野の研究者がDNA-タンパク質相互作用、RNA、折り畳み、およびナノ粒子設計を探索することを可能にし、発生異常やがんなどの疾患への理解を深め、新たな治療薬を設計するための道を開きました。