内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

この手順の全体的な目的は、内向き整流カリウムチャネルの活性を調節する新規化合物を探索することです。まず、目的のKIRチャネルを発現するテトラサイクリン誘導性HEK 293細胞を384ウェルプレートに播種します。次に、FluoIn-T2という蛍光タリウムレポーター色素を細胞に導入します。

次に、細胞から未結合の色素を洗浄し、ビークルコントロールまたは試験化合物を含むアッセイバッファーに置換します。最終ステップとして、ウェルに刺激バッファーを添加し、タリウムフラックスを開始させます。最終的に、蛍光プレートリーダーを用いて、KIRチャネルを介したタリウムイオンの移動を変化させる化合物を同定します。Poor.

手動パッチクランプ電生理学などの既存の技術に対する本手法の主な利点は、研究者が数百件の実験を同時に、そして1日に数千件の実験を行うことができる点にあります。本手法を用いることで、研究者は数千種類の低分子化合物ライブラリをスクリーニングし、内向き整流性カリウムチャネルのモジュレーターを探索することが可能です。タリウムフラックス実験の前日に、付属の原稿に記載されている通りに細胞を分散させ、細胞懸濁液の密度を定量します。次に、10%透析FBSを含むBH培地を用い、KIRチャネル遺伝子を安定的に転換させたモノクローナル細胞 20,000個を、Thermo MultiDrop Combiまたはマルチチャンネルピペッターを使用して、BD PureCoat Aminコーティング384ウェルプレートの各ウェルに播種します。翌日、顕微鏡下でプレートを確認し、細胞が接着し、ウェルの底面に均一に分布していることを確認してください。

次に、ELX 405マイクロプレートウォッシャーを用いて、細胞培養培地を1ウェルあたり20 µLのHBSSアッセイバッファーに置換します。その後、チューブを短時間遠心して50 µgのflus in twoパウダーを100 µLの無水DMSOに溶解させ、2:00 AM Dローディング溶液中のflusを調製します。

次に、20% w/v の onic F1 27 DMSO 溶液 50 µL を色素に加えます。ピペッティングにより緩やかに混合します。その後、onic F1 27 2:00 AM の flus 150 µL を 35 mL の HBSS アッセイバッファーに加え、緩やかに混合します。

次に、20 µLのHBSS assay.Bufferが既に分注されている各ウェルに、20 µLの染料ローディングバッファーを加えます。細胞に染料をロードさせるため、室温で約1時間インキュベートします。50 mLの5x thallium stimulus bufferに0.5 gの炭酸水素ナトリウムを新たに溶解させ、タリウム刺激プレートを準備します。

次に、ポリプロピレン製384ウェルプレートの各ウェルに、溶液を50 µLずつ加えます。細胞にフルオレセインをロードした後、ELX 405マイクロプレートウォッシャーでプレートを洗浄します。続いて、各ウェルに20 µLまたは40 µLのHBSSアッセイバッファーを加えれば、実験の準備は完了です。

タリウムプレートおよび細胞プレートを、液体分注機能を備えたHema Matsu機能的薬剤スクリーニングシステムまたは同等のキネティックイメージングプレートリーダーにロードし、Fluo-4などのフルオレセイン系色素に適したフィルターを使用します。その後、40 µLのHBSSアッセイバッファーを含む細胞プレートの対応するウェルに、5Xタリウムシリーズを10 µL添加するシングルアドプロトコルを設定します。次に、サンプリング周波数1 Hzで、少なくとも10秒間ベースライン蛍光を記録します。

最適な細胞播種、洗浄、およびローディング条件が確立されれば、プレート全体のウェル間の蛍光は均一かつ安定する必要があります。その間に、組み込みの384チャンネルピペッターを使用して、各ウェルにタリウム刺激バッファーを同時に添加し、タリウム誘起による蛍光増加の速度とピークをオフライン解析で捉えられるよう、少なくとも2分間記録を継続します。次の一連の実験では、384ウェルプレートの各列および各行の1つおきのウェルにコントロール阻害剤を播種し、その他のウェルにはビークルコントロールとしてDMSOを添加することで、アッセイの均一性と再現性を評価します。

マルチチャンネルピペットを使用します。あらかじめ決定した濃度の標的KIRチャネル阻害剤および0.1% DMSO溶媒を、1ウェルあたり80 µLずつ384ウェルポリプロピレンプレートに分注し、化合物DMSOプレートを作成します。これは、既知の阻害剤をウェルA1から順に、B2へと交互に、B24まで加えて行うことで実施します。

この手順を、B1ウェルからA24ウェルまで、DMSOを用いて順次繰り返します。次に、細胞プレート、化合物プレート、およびタリウム刺激プレートをプレートリーダーにセットします。その後、HBSSアッセイバッファー 20 µLを含む細胞プレートの対応するウェルに、2倍濃度の化合物シリーズを 20 µL添加するための2回添加プロトコルを設定します。

化合物をセルプレートに加え、室温で最大20分間インキュベートします。2つの蛍光波長でベースラインの蛍光を少なくとも10秒間記録します。その後、セルプレートの各ウェルに5倍濃度のタリウムバッファーを10 µL加えます。

結果の再現性を確認するため、3日連続で実験を繰り返します。DMSOを加えたタリウムフラックスおよび薬剤処理した細胞を用いて、Zプライム値を算出します。2つのウェル群間のウェル間変動の統計的指標であるZプライムは、P（非抑制フラックス値）とN（完全抑制フラックス値）の平均値と標準偏差に基づき、以下の式を用いて算出します。

3日連続でZPrime値が0.5以上となったアッセイは、ハイスループットスクリーニングに適していると考えられます。これらの図は、異なる種類の実験で使用されるセルプレーティングマップの例です。未誘導細胞またはテトラサイクリン誘導細胞を含むウェルの位置が、それぞれ異なる色で示されています。

この図は、アッセイの開発および化合物スクリーニングにおいて最適なタリウム濃度を決定するために使用したソースプレートマップを示しています。カラーグラデーションは100%から0.002%までのタリウムの3倍希釈系列を表しており、ここでは寒色から暖色で示された代表的な蛍光強度マップにより、タリウムフラックス値の低から高への変化を示しています。ここに示されている細胞播種マップとタリウムCRCへの4パラメータロジスティック関数のフィッティングにより、EEC 80値をタリウム15%と決定しています。

この図は、アッセイのDMSO耐性を決定するために使用したソースプレートマップを示しています。1列目と24列目はアッセイバッファーのみを含み、カラーグラデーションは10%から0.01% DMSOまでの2倍希釈系列を示しています。また、ここでは代表的な蛍光強度マップを示しており、タリウムフラックス値が低いウェルほど濃い青色で表示されています。指定した濃度のDMSOを含むウェルから記録された平均タリウムフラックス値をここにまとめます。

この図は、KIRチャネルの既知の阻害剤について濃度反応曲線を確立するために使用したソースプレートマップを示しています。各化合物は異なる色で表示されており、通常は3倍希釈系列としてプレートに分注されます。ここでは代表的な蛍光強度マップを示しており、この図は、開発および最適化後の阻害剤によるタリウムフラックスの用量依存的な抑制を示しています。

タリウムフラックスアッセイは、さまざまなルーチンの薬理学的アッセイにも利用可能です。タリウムフラックスアッセイは、電位依存性およびリガンド依存性カリウムチャネル、非選択的陽イオンチャネル、さらにはカリウム輸送体への適用にこれまで適応されてきました。タリウムの取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は、手袋の着用や適切な廃棄物処理などの予防措置を常に講じてください。