ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

この手順の目的は、細菌毒素に対する免疫細胞の応答を可視化することです。まず、BL 21 gold cellsを用いて毒素を発現させ、精製します。毒素の活性と濃度を確認した後、免疫細胞に毒素を添加します。

マイクロインジェクターと高速ライブセル顕微鏡を用いて解析を行います。得られた画像の解析により、毒素に対する免疫細胞応答のリアルタイムキネティクスが明らかになります。この手法は、インフラマソーム活性化のメカニズムなど、免疫学分野における重要な疑問の解決に寄与します。

この手法は毒素による免疫細胞応答の知見を得るために有用ですが、化学走性因子を含む他の刺激にも適用可能です。本手法の着想は、細菌と培養免疫細胞の相互作用を研究していた際、細菌と免疫細胞の間で相互作用に非常に大きなばらつきがあることを観察したことにあります。まず、pAG3-SLOを含むBL21 Gold細胞を培養し、ストレプトリシンO（SLO）の精製を開始します。

HisプラスミドをODが約0.6になるまで培養します。タンパク質発現を誘導するため、培養液に20% OSesを5 mL加え、室温で225 RPMで3時間振とうします。次に、細菌を500 mL遠心ボトルに移します。

次に、培養物を 4 °C で 12,000 ×g、12 分間遠心分離し、遠心後、上清を除去します。ペレットを -80 °C で一晩、または必要に応じてそれ以上の期間保存します。発現した SLO を精製するには、Triton X 100、リゾチーム、およびフェニルメチルスルホニルフッ化物（PMSF）を添加した ly wash buffer 10 mL を凍結ペレットに加え、ピペッティングを約 15 分間繰り返します。

再懸濁させるため、サンプルを氷上に置いたままペレットを懸濁させます。再懸濁したペレットを50 milliliterのオークリッジ製丸底ポリプロピレンチューブに移します。プローブ型ソニケーターを用い、出力40%で30秒間の処理を30秒間隔で5回行い、各処理の間は氷上で30秒間冷却してライセートをソニケーションします。

次に、超音波処理したライセートを4°Cで20分間、39,000 ×gで遠心分離します。遠心分離後、細菌の上清を1 mLの洗浄済みニッケルNTAアガロースに加えます。ニッケルNTAアガロースとライセートを、4°Cで緩やかに振盪しながら2.5時間インキュベートします。

4°Cで400 ×gにて5分間遠心分離し、ビーズをペレット化します。特に断りのない限り、以降のすべての洗浄および溶出操作は、この遠心分離条件で実施することに注意してください。遠心分離の後、

30 µLの上清と10 µLの4倍濃度SDSサンプルバッファーをマイクロ遠心チューブ内で合わせ、純度分析のために氷上に保存します。その後、残りの上清を除去し、ビーズを氷冷した洗浄バッファーで4回洗浄します。各洗浄の間に、塩類含有バッファーで1回遠心分離を行います。ここからは、サンプルを常に氷上で保持してください。

SLOは非常に酸化還元感受性の高いタンパク質であり、短時間であっても37 °Cに温められると速やかに活性を失います。SLOタンパク質を溶出させるには、溶出バッファー1 mLと1 M DTT 5 µLをビーズに加え、氷上で10分間インキュベートします。その後、遠心分離を行い、溶出番号を記載した遠心チューブに上清を回収します。

この工程を3回繰り返し、次にSLOタンパク質からエンドトキシンを除去するため、res saltバッファーに懸濁させた洗浄済みのpoly mixing結合agro beads 200 µLをサンプルに添加し、4°Cで30分間振盪します。その後、4°Cで10,000 ×gにて1分間遠心分離します。遠心後、上清をラベル付きの新しいマイクロ遠心チューブに回収します。

各溶出液 30 µL に、4倍濃度のSDSサンプルバッファー 10 µL を混合します。SDS-PAGE分析用として、SLO溶液を氷上で保存します。タンパク質濃度と溶血活性を測定し、十分な結果が得られた場合は、SLOEを 5〜10 µL ずつ分注し、ドライアイスで急速凍結した後、-80 °C で保存します。

次に、特異的溶血率を決定します。Reese法を用います。テストする細胞を2倍に懸濁します。20 µg/mLのbuffer RBを用いて、1 mLあたり6×10⁶個の細胞を調製します。

プロピジウム йоウ化物。ここでは T 27 A 細胞を用いて試験を行います。個別のマイクロ遠心チューブに入った細胞を、96ウェルV底プレートの各ウェルに 100 µL ずつ分注します。

バッファーrbを用いて、SLOを最終濃度の2倍になるまで連続希釈します。次に、毒素100 µLまたはバッファーRB 100 µLを細胞に加え、37 °Cで5分間インキュベートします。一般的な最終濃度は、2000 units/mLから31.25 units/mLの範囲です。

フローサイトメーターで細胞を解析し、Fi、Cethrin、またはPEのフィルターを用いてデータを収集します。1 logのシフトは一時的に透過性が高まった細胞を示し、3 logのシフトは死細胞であることを示します。コントロール群の死細胞の割合を実験群から差し引くことで、以下の式を用いて細胞の特異的溶解率を算出します。実験の1日前に、2×10⁵個のマクロファージをコラーゲンコートしたガラス上に播種します。

底面35 millimeterディッシュを使用します。毒素導入に使用する顕微鏡には、倒立ステージ、加熱ステージ、適切な励起・蛍光フィルターキューブ、および可能であればベルタンレンズを備えている必要があります。本手順において最も困難な点は、ニードルを破損させることなく細胞まで降ろすことです。

確実に成功させるため、通常はアライメントに使用されるベルトラントレンズを用いて、焦点平面に針を導入する際にその視覚的な確認を行います。顕微鏡はマイクロインジェクターに接続し、データの収集および保存に十分なメモリを備えたコンピューターで制御してください。顕微鏡とマイクロインジェクターの電源を入れ、ステージが加熱されるまで待ち、加熱ステージが37 °Cに到達するようにします。37 °Cで30分間、色素を用いて細胞を標識します。

アッセイに応じて、ラベリングは5 µL、4 µL、または1 mLのHBSSに含まれる2 µLのカルシウム、あるいは1 mLの完全培地に含まれる2 µLのカルシウムを用いて行われます。ここでは、4 µLまたは2 µLを使用します。細胞培地を除去し、PBSで細胞を1回洗浄します。PBSを吸引し、2 mMの塩化カルシウムを添加した1 mLのRPMIに置換します。

ディッシュを顕微鏡にセットし、明視野で細胞にピントを合わせ、その後、細胞のわずか上にピントが合うように調整します。次に、1 µLのSLO toxin、4 µLのDEXTRA 5 55（10 mg/mL）、および6 µLの水を混合します。その後、4 °Cで10分間、20,000 ×gで遠心分離します。

デキストランは、フェムトチップに詰まりがないことを確認するために使用されます。マイクロローダーを用いて、希釈した毒素 2 µL をフェムトチップの後方からロードします。その後、フェムトチップをマイクロインジェクターに装着します。

次に、インジェクターの角度を調整し、チップが細胞の中央に位置し、かつ全方向に動かせる余裕を持たせます。マイクロインジェクターのチップが到達できる下限を制限する、前回のZ制限の設定をクリアします。マイクロインジェクターを、120 PSIで0.5秒間注入し、バックプレッシャーを20 PSIに設定します。その後、チップを培地に浸かるまで下げます。

ベルトランレンズを使用します。チップを中央に合わせ、細胞に近づけるようにチップを下げながら追従させます。ニードルにピントが合わなくなったら、通常の光学系に戻してください。

視野内に針の影が見えるはずです。細胞よりも上の位置に焦点を合わせ、針にピントが合うまで針を下げます。その後、細胞に焦点を合わせ、慎重に針を細胞の隣まで移動させます。

注入のためのZリミットを設定した後、イメージングを開始し、毒素を注入します。次に、針を上げて細胞の新しい領域へ移動します。さらに毒素を注入し、注入後のイメージングを継続します。

このビデオで説明する方法に従い、ニードルをホームポジションに移動させ、意図しない毒素の漏出を防ぎます。10⁷〜10⁸ units/mL。SLOは通常、4 mg/mLのタンパク質濃度で得られます。このSDS-PAGEゲルは、毒素誘導前後の細菌サンプルと、精製後の3つの溶出分画を示しており、クマシーブルー染色により、誘導されたSLOが正常に精製されたことがわかります。

SLOは69 kilodaltonsのバンドであり、T 27 AまたはD two細胞の溶解に必要な毒素量を決定するために使用されます。細胞にさまざまな濃度のSLOを、propidium iodide存在下で37 °Cで5分間処理し、フローサイトメトリーで解析しました。特異的溶解は、ここに示すように決定されました。

1 mLあたり250ユニット。SLOはT 27 A細胞とD2細胞の両方に対して50%の溶血を引き起こします。毒素の亜溶血量である10%溶血量は、1 mLあたり62.5ユニットとなります。

これらの値は、毒素への曝露後に細胞死を評価するための、ベンチマークとなる毒素活性にとって重要です。ヒト真皮線維芽細胞を、Life Technologies社のLive-Deadキットを用いて、カルシウムおよびatheriumホモダイマーと共にインキュベートしました。細菌毒素anthro lysin Oへの局所的な曝露後、この画像では、カルシウムが緑色で、マイクロバイオームに近い領域のatherium bromideが赤色で示されています。カルシウムの消失とatheホモダイマーの取り込みを特徴とする細胞死が示されており、一方で先端から遠い領域では損傷が見られません。

毒素を微量送達することで、カルシウムフラックスなどのリアルタイムイベントの解析が可能になります。4:02 AMを負荷したこれらのヒトdcsを、一定の流速でSLOに曝露させ、同時にライブイメージングを行いました。緑色から青色への変化は、細胞質カルシウム濃度の増加を擬似カラーで示しています。

SLOは細胞質カルシウムの急速な上昇を誘導し、局所的な投与によってディッシュの当該領域に伝播します。しかし、マイクロインジェクターのチップに近い細胞のみが毒素に接触し、反応します。これにより、毒素に対する単一細胞の反応と、z軸方向のイベントを解像するための毒素投与の空間的に制限された領域の両方が実証されます。

マイクロデリバリーを高速3D共焦点顕微鏡法と組み合わせました。この一連の画像は、毒素注入後の樹状細胞を示しています。細胞膜を標識するため、あらかじめ緑色で示されるPC結合抗CD11cでプレインキュベーションされています。

ここで見られるように、毒素の導入後にマイクロベシクルが放出されます。細胞修復プロセスの一環として、毒素分子がブレブに濃縮され、毒素を除去するために脱落します。習得すれば、顕微鏡観察は45分で完了できます。

この手順を実施する際は、細胞と混合するまで毒素を低温に保つこと、および溶血活性を確認することを忘れないでください。これで完了です。このビデオを視聴したことで、ライブセルイメージングを用いて細菌毒素に対する免疫細胞応答のリアルタイムキネティクスを測定する方法について、十分に理解できたはずです。