胚におけるプログラム細胞死を検出するためのLysoTrackerの使用は、胚性幹細胞を分化

本手順の目的は、細胞死のパターンを検出するために、2種類のサンプル（マウス胚および分化幹細胞）のリソソームをLysoTracker染料で染色し、維持する方法を実演することです。胚サンプルの調製では、まず手術的に胚を単離し、分化細胞を調製するためにディッシュに配置します。胚体の作製には、胚性幹細胞を使用します。

これらの胚体は浮遊状態で培養し、その後チャンバースライド上で単層として成長させます。すべての胚単層をLysoTracker Redでインキュベートし、洗浄および固定を行います。その後、サンプルを撮影して染色の結果を観察し、定量化します。LysoTrackerによる染色は、胚や培養細胞におけるプログラム細胞死を評価するために利用できる簡便な手法です。

トンネル解析などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、OTトラッカー染料が低分子であるため、厚い組織を迅速かつ容易にアッセイできる点にあります。この方法は、マウス胚や分化培養におけるプログラム細胞死のパターンの知見を得るのに有用ですが、鶏胚や分化中の成体幹細胞などの他の組織型にも適用可能です。若い雌マウスを種オスとペアリングさせ、翌朝以降、交配が行われたことを示す腟栓があるかを確認します。

腟栓が確認された日の正午を実質的に0.5日目とします。目的の胚齢で交配後、承認済みのプロトコルに従って雌を安楽死させ、子宮をHank's BSSを入れた10 cmのペトリ皿に取り出し、血液を洗い流します。胚を分離し、子宮から取り出します。

余分な胚膜を取り除き、Hank's BSSで少なくとも1回洗浄して、不要な組織や血液を除去します。洗浄中は、解剖した胚を氷上に保持します。その他を。

Liso tracker胚染色液を5 mL調製します。この量は、1〜2回の胚回収に十分な量です。溶液を静かに混ぜて染料を均一に分散させ、その後、胚を溶液に移し、37 °Cで45分間インキュベートします。

インキュベーション後、胚をHank's BSSで5分間ずつ4回、穏やかに洗浄します。組織を損傷させないよう、洗浄は慎重に行うことが重要です。液を除去する際は、繊細な胚の位置に細心の注意を払い、常に胚が浸っている程度の液を残すようにゆっくりと行います。

その後、胚を4%パラホルムアルデヒドで一晩固定します。翌日、固定剤を除去するために、胚をHank's BSSで10分間1回洗浄します。次に、バックグラウンドの染色を排除するため、メタノール系列を用いて組織を脱水します。

このステップは、保存前のイメージングにおける信号対雑音比を向上させます。必要に応じて、遺伝子解析用に各胚から組織サンプルを採取してください。その後、ジェノタイピングの前に組織サンプルを再水和させます。

胚を、組織サンプルと一致するラベルを貼った個別のチューブに分けて入れます。これで、単離した胚を-20°Cのメタノール中で無期限に保存することが可能です。遮光して保存してください。

まず、吊下滴法を用いて胚体を調製します。3日後、20 µLの滴あたり500細胞の初期密度で、胚体を10 cmの非接着性ペトリ皿上の懸濁培養へと移します。5日間培養し、その後は2日ごとに培地を交換しながらさらに5日間培養します。

胚体をゼラチンコートした8チェンバーのスライドへ移し、各チェンバーに1つまたは2つの胚体を配置します。胚体をさらに10日間培養します。10日後から1日おきに培地を交換し、既存の培地を緩やかに吸引除去した後、各チェンバーに300 microlitersのLyo tracker細胞染色溶液を加えます。

ピペットチップをチャンバーの隅に配置し、手作業で培地を丁寧に吸い出してください。これにより、ガラス表面に付着しつつある個体を誤って除去することを防げます。培地を再び加える際は、ピペットチップをチャンバーの隅に配置し、非常にゆっくりと培地を戻してください。

チャンバーを37 °Cで15分間インキュベートします。次に、DPBSで1回5分間、計2回洗浄します。その後、4%パラアルデヒドを用いて、室温で15分間細胞を固定します。

次に、DPBSを用いて5分間の洗浄を2回行い、固定剤を除去します。胚をマウントするために、深いディンプルガラススライドまたは小型ペトリ皿に移します。DPBSを吸引して、細胞サンプルを顕微鏡観察用に準備します。

スライドからチャンバーを取り外し、5分ほど自然乾燥させます。蛍光色素を保護するため、アルミホイルで覆います。次に、DAPI配合のVector Shieldなどの水溶性封入剤を加え、カバーガラスを載せます。

スライドの封入が完了し、イメージングの準備が整いました。ロッド、ドミネ、またはテキサスレッドフィルターを備えた実体顕微鏡または光学顕微鏡でサンプルを観察してください。染色は通常かなり鮮やかであるため、マニュアルモードで長時間露光させる必要はほとんどありません。

すべてのサンプルを同一の露出条件下でデジタル写真で撮影します。画像を定量化するために、Adobe Photoshopまたは同様の画像解析プログラムで写真を開きます。Lyo Tracker染色の量を決定するために、レッドチャンネルを選択します。

ヒストグラム機能で表示される画像全体のピクセル数を確認します。次に、赤色の染色部分が白色のピクセルで表されるように画像を二値化します。これにより、画像が白黒に変換されます。

閾値レベルを決定し、セット内のすべての画像にこのレベルを適用します。カラーレンジツールを使用して白色のピクセルを選択し、ヒストグラム機能を用いて白色ピクセルの総数を算出します。視野内の核の数をカウントするには、ブルーチャンネルを使用してください。

画像に注釈を付けてカウント数を記録し、その値を書き留めて、細胞あたりの平均染色レベルを算出すると有用です。残りのすべての画像についても、同じ閾値設定でこの解析を繰り返します。サンプリングには、sonic hedgehog変異胚を染色するためにLysoTrackerを使用しました。

ly O trackerは小さく拡散性の高い分子であるため、交配後10.5日の全胚を染色し、胚内部の深部領域を観察した。その結果、sonic hedgehog欠損変異体胚では、特に肢芽および体節領域において、プログラム細胞死（PCD）が著しく増加していた。全体のパターンを評価するため、肢芽をホールマウント状態で高倍率にて撮像した。また、摘出した部位をバイブレーティングミクロトームで切片化した。

矢印は、クライオスタットで得られた切片におけるsonic hedgehog欠損遠位先端のTUNEL染色の増加を示しています。これらのスライスではOT Trackerと併せてTUNEL染色が行われました。LysoTrackerとTUNEL染色の間に厳密な一対一の相関はありませんが、高倍率下ではPCD（プログラム細胞死）の一般的な領域がかなり重複しています。TUNELアッセイで陽性と染まった細胞、LysoTrackerのみで染まった細胞、および染色の重複がある細胞を確認することができます。10日間の胚体培養後、細胞はニューロン、筋細胞、心筋細胞を含むさまざまな細胞型に分化した。

分化したES細胞の通常の培養において、lyo trackerおよびTUNELアッセイで検出される、PCDを起こした細胞が少数存在しています。次に、酸化ストレスによる細胞死を誘導するため、細胞に過酸化水素を処理しました。低濃度の過酸化水素処理により、未処理の場合と比較してlyo trackerおよびTUNEL染色の両方が増加しました。

胚での結果と同様に、両方の染色によって共通の細胞と固有の細胞の両方が標識されました。高濃度の過酸化水素を投与したところ、細胞の収縮が起こり、OTトラッカーおよびTUNEL陽性反応がより広範囲に認められました。比較のため、1時間の血清飢餓によってオートファジーを誘導し、血清飢餓状態での検討を行いました。

OTトラッカーの染色は増加しました。しかし、TUNEL陽性率は正常レベルのままでした。したがって、reerは簡便で有用ですが、サンプルの定量後に、その染色がアポトーシスを示すのか、あるいはオートファジーを示すのかを判断するために、追加のアッセイで追跡調査を行うことが重要です。

前述の簡単なPhotoshopの手法を用いた結果、過酸化水素の濃度を高めることでLysotracker染色のレベルが上昇することが確認されました。この染色手順を習得し、適切に実施すれば、2時間以内に完了させることができます。細胞死の形態を確認するために、Annexin V染色やLC3免疫染色などの他の手法を併用することが可能です。なお、Tracker Greenは生細胞にのみ有効であるため、固定が必要な試料にはLysoTracker Redが最適です。