タンパク質の折り畳みを研究するためのマイクロ流体ミキサー

この手順の全体的な目的は、2つの溶液を急速に混合し、マイクロ秒スケールで生化学反応を開始させることです。これは、まずマイクロ流体ミキサーを作製し、次にチップをカバーガラスに接合して流路を封止することによって達成されます。

次に、チップを溶液リザーバーを含むマニホールドに取り付けます。最終ステップは、共焦点蛍光顕微鏡を用いて混合溶液をイメージングすることです。最終的に、出口チャネルに沿った距離を時間に変換することで、生化学反応をマイクロ秒の時間スケールで捉えます。

ストップフロー混合などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、混合が乱流に制限されず、数マイクロ秒で完了することです。この手法は、疎水性崩壊はいつ起こるのかという、タンパク質折りたたみ分野における重要な疑問への回答に寄与します。マイクロ流体混合チップの作製を開始するため、私の研究室のポストドクターであるLing Wooが手順を実演します。

まず、本ビデオに付属する書面プロトコルに記載されている通り、新鮮なピラニア溶液を用いて4インチのFUシリコンウェハーを洗浄します。次に、低圧化学気相成長（LPCVD）炉を使用し、最終的なマイクロ流路の予定深度10 µmにつき、約1 µmの厚さのポリシリコンコーティングを施します。テキストに記載されているウェハーのさらなる処理の後、ウェハーに厚さ900 nmのZ 52 14フォトレジストをスピンコートし、ホットプレート上で直接90 °Cで1分間、またはオーブンで110 °Cで30分間ソフトベークします。

フォトマスクをアライメントした後、まずフォトレジストにUV光を数秒間照射し、ハードコンタクトおよび真空コンタクトを行います。次に、書面によるプロトコルに従って、フォトレジスト内のパターンを現像します。ウェハー上の形状を顕微鏡で検査し、ホットプレート上で直接115 °Cで2分間ハードベークします。

次に、Asherまたは酸素プラズマを用いて、RF出力100 Wで2.5分間、ウェハのDCUを行います。深掘り反応性イオンエッチャーを使用して、ポリシリカ層を下の合成石英まで完全にエッチングします。残ったフォトレジストを除去し、本文の指示に従ってウェハを処理します。

エッチング深さを測定し、ポリコーティングを完全に貫通していることを確認します。酸化膜に対応した深反応性イオンエッチング装置を使用し、ポリコーティングの厚さ1μmあたり約10μmの深さまで溶融シリカをエッチングします。マトリックス・アシャーを用いて、RF出力100Wで4分間ウェハを洗浄し、その後キセノンジフルオリドエッチング装置でポリシリコンを除去します。ウェハへの穴あけ加工を行う前に、以降の取り扱い中にチャネルを保護するため、1μmのフォトレジストを新たにスピンコートします。

次に、Aqua Bond 55を使用して、ウェーハのパターン面を下にして犠牲ガラスプレートに固定します。ボンディング時に気泡が入らないように注意しながら、micro 90洗浄液を用いて、コンピュータ制御のダイヤモンドチップドリルで冷却します。これにより、微細なガラス片がチャネルに付着し、使用中にチップが詰まるのを防ぎます。

各チップに、入口および出口となる穴をドリルで開けます。シリンジを用いて各穴に水を注入し、ウェハを脱イオン水で洗浄します。その後、フォトレジストを除去し、石鹸水に1時間浸漬させます。

本文に記載されている通り、レジストおよびボンダーを塗布します。ウェハを脱イオン水と温 soapy water で洗浄します。ウェハに窒素を流した後、エッチングされた構造部分を避けながら、シリンジを用いて各孔を再度洗浄します。

120 °Cに設定した真空乾燥機で乾燥を続けます。穴の中に不純物が残っていないか確認し、必要に応じて洗浄手順を繰り返してください。以下の手順はクリーンルーム内で実施してください。

光学式または機械式の表面プロファイラーを用いて、チャネルの深さを測定します。クリーンルーム内で、本文の記載に従ってウェハおよび溶融石英カバーガラスを洗浄します。窒素ガスを用いて、ウェハを少なくとも5分間十分に乾燥させます。

次に、小さなガラス板などの硬く平らな面の上にクリーンルームワイパーを3～4枚重ねて置き、その上にウェハのパターン面を上にして置きます。カバーガラスについても同様に行います。カバーガラスの端を持ち上げて反転させ、研磨面がウェハに向けて下になるように保持します。

平坦な端を慎重に合わせ、カバーガラスをウェハの上にそっと落として静止させます。位置を調整する場合は、水平方向にのみわずかに動かしてください。ウェハの中央を指一本で押し下げます。すると、接合界面が外側に向かって放射状に広がり始めるのが確認できます。

必要に応じて、接合界面を前進させるためにウェハー周囲の他の箇所に追加の圧力を加えます。密封したウェハーを、本文に記載された温度プロファイルに設定した高温オーブンに入れ、その後、ウェハーダイシングソーを用いてウェハーを個々のチップにダイシングします。ミキシングチップと溶液を保持するためのマニホールドは、レキサンやプレキシガラスなどのプラスチック、またはアルミニウムで作製できます。

温度制御を行うため、小型のOリングを用いてチップをマニホールドに装着し、チップ中央の光学的な視認性が確保されるリテーニングリングで固定します。チップに過度な圧力をかけずに良好な密着性を確保するため、Oリングの溝は標準よりも浅く設計してください。チップの装着後、中央および側面のリザーバーに溶液を注入します。その際、ウェルの底に気泡が溜まっていないよう注意してください。

マニホールドを倒立顕微鏡の上に設置し、接眼レンズまたはカメラ出力で混合領域を観察します。マニホールドの上に白熱式懐中電灯を置くことで、十分な光量が得られます。ジェットを確認するには、センターチャネルに色素または高屈折率溶液を使用してください。

このミキサーで使用される容量は非常に小さいため、溶液ウェルの上部に空気圧をかけることで流れを制御できます。ジェットを可視化するには、まずサイドチャンネルの圧力を0 psiに設定し、センターチャンネルと同圧になるまでゆっくりと上げていきます。片方のサイドチャンネルが詰まっている場合、ジェットは出口チャンネルの壁面のいずれかに押し付けられます。

目視で詰まりが確認された場合は、シリンジを用いて出口チャネルに圧力または真空をかけることで除去できる可能性があります。タンパク質やその他の有機物によってチップが詰まった場合は、ピラニア溶液に一晩浸漬することで洗浄可能です。ダイクロイックミラーを用いて、顕微鏡内部または直外から、コーティングされたレーザービームを研究用顕微鏡内に導入してください。

接眼レンズまたはカメラで、混合領域の近くに焦点が見えるようにレーザーを調整します。ミキサー内のタンパク質からの蛍光は対物レンズで収集され、ダイクロイックミラーを通過した後、レンズで集光されてピンホールに送られ、フォトカウンタで結像されます。ピエゾ電気スキャナーを用いてチップをx方向およびy方向に走査し、混合領域をイメージングします。

ジェット上の位置を選択し、X方向およびY方向にスキャンして、チャネル中心の垂直方向のフォーカスを合わせます。顕微鏡の被写界深度はチャネルの深さに比べて非常に小さく、また流速は壁面から1 micron以内を除いてチャネル内で均一です。したがって、観察される蛍光の時間分解能は、主に共焦点スポットのサイズによって決定されます。

出口チャネル内を、ジェットに沿って100 micron間隔で水平にスキャンし、各位置で約1ミリ秒間観察します。その後、より遅い時間を捉えるために、顕微鏡ステージをジェットに沿って80～90 micron移動させます。あるいは、ダイクロイックミラー後の光をレンズで集光して入射スリットに導入し、分光器とCCDで検出することも可能です。

データ収集はフォトカウンタよりも時間がかかるため、通常はまずフォトカウンタでジェットの画像を取得し、その後分光計を用いてジェットに沿った各点の測定を行います。フォトカウンタのデータは、各位置でジェット周囲の3〜5ピクセルを合算することで解析し、強度対距離のプロットを作成します。時間は、印加圧力に基づいて算出された速度を用いて、距離から計算します。

最終ステップとして、本文で説明した手法のいずれかを用いて分光計からのデータを解析します。ここに、フォトンカウンターで測定した混合領域の強度のコンタープロットを示します。ジェット外の出口チャネルにおけるバックグラウンドは、検出器のノイズフロアに近い値となるため、通常は差し引きません。

背景値が高い場合は、アライメントが不適切であるか、あるいはタンパク質がチャネル壁に付着している可能性があります。逆に、特に混合領域付近でジェットが屈曲していたり歪んでいたりする場合は、ノズルのエッチングが不十分であることを示しています。Alexa 488およびAlexa 647で標識したタンパク質A CBP（ACell coenzyme a binding protein）の時間分解スペクトルを以下に示します。

緑と赤の長方形は、それぞれドナーチャネルおよびアクセプターチャネルとして指定された波長を示しています。このデータは、ダークチャージとレーザー信号を除去するために背景減算処理が行われています。背景信号は、センターチャネルの圧力が0 psiなどの状態で取得されました。

混合時間は、ヨウ化カリウムによるトリプトファン蛍光の消光など、混合よりもはるかに速い迅速反応を測定することで測定できます。ジェットは顕微鏡の光学分解能よりも小さいため、混合領域では強度が大幅に低下します。ジェットが形成される際、溶液条件を変更せずにコントロール測定を行うことで、この装置応答を除去することができます。

この図には、N-アセチルトリプトファンアミドの蛍光における混合実験と非混合実験の比率が示されています。直線は、COMSOL Multiphysicsによるモデリングおよびシミュレーションから予測されたヨウ化カリウムの濃度を表しています。濃度が80%減少するまでにかかる時間として測定された混合時間は、8マイクロ秒です。

このプロットは、変性剤を6 molarから0.06 molarに希釈した後のタンパク質A CBPにおけるfretの変化を示しています。このデータにコントロール実験は必要ありません。fretはすでに比率であり、装置の応答も既に取り除かれているため、T=0付近の急速なジャンプは、混合時間内でのfret信号の急速な変化を表しています。

この開発を経て、本手法はタンパク質折り畳みの分野の研究者が、タンパク質構造形成における初期段階を探索するための道を切り拓きました。