SeqA-DNA複合体の結晶化のためのDNA二重鎖の反復最適化

本実験では、タンデムにヘミメチル化されたGATCを含むDNAに結合したタンパク質の、回折品質の結晶を得る方法を詳述します。タンパク質-DNA複合体の結晶パッキングを促進させるために、これを繰り返します。まず、DNAの長さ、GATCの間隔、およびDNA末端を合理的に設計し、次に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを用いてDNAを精製し、アニールさせてヘミメチル化DNA二本鎖を形成させます。その後、精製したseq Aを混ぜて複合体を形成させます。

次に、市販のスパースマトリクススクリーンを用いた結晶化試行により、回折品質のタンパク質-DNA複合体結晶を成長させるための最適条件を検討します。実証結果を示します。DNAの長さ、GATCの間隔、および末端の変化がCQ A DNA結晶の回折品質に及ぼす影響について共有します。

本研究の目的は、DNAに結合したCKの回折品質の結晶を得ることでありますが、本手法は、他のタンパク質-DNA複合体の結晶化に向けてDNA二本鎖を設計する際に考慮すべき一般的な変数を理解する上でも役立ちます。なお、この手順は私の研究室の博士研究員であるChang, Aに使用される予定です。本研究では、安定した二量体を形成し、二量体化ドメインとDNA結合ドメインの間のリンカー領域が短縮されたDNA複製調節タンパク質の変異体を使用します。

この変異体は、DNA結合を、DNA上のちょうど1回転分のみで隔てられたタンデムGATCリピートに限定します。まず、T7プロモーターの制御下でDEMETRIC-seq AをコードするプラスミドをBBL 20 1D3細胞に形質転換します。形質転換反応液を、100 µg/mLのアンピシリンを含むLB寒天プレートに播種し、細菌培養インキュベーターで一晩培養します。混在コロニーをピックアップし、小スケールの一晩培養を開始します。

翌朝、1リットルの培養液に10ミリリットルの overnight 接種源を接種します。培養が対数増殖期に達したら、タンパク質発現を誘導するために0.5 molar IPTGを2ミリリットル添加します。37 °Cの振盪培養機でさらに3時間インキュベーションを継続します。

次に、3,300 Gで10分間遠心分離して細胞を回収します。回収した細胞ペレットを精製バッファーAで懸濁し、超音波処理によって可溶化させ、39,000 ×gで40分間遠心分離してライセートを清澄化します。得られた上清を、精製バッファーで平衡化したヘパリンカラムにロードします。

CKタンパク質を溶出させる。1 Mの塩化ナトリウムを用いた線形勾配を使用する。CKタンパク質は約0.7 Mの塩化ナトリウムで溶出する。CKを含む画分を回収し、希釈してサンプルのイオン強度を下げる。

次に、精製バッファーで平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにサンプルをロードします。線形塩濃度勾配を適用し、約0.4 Mの塩化ナトリウムで純粋なCKタンパク質を溶出させます。CKを含む画分を回収し、合わせます。

3 mg/mLまで濃縮し、保存容器に保存する。バッファー設計に基づき、相補的な非メチル化およびメチル化オリゴヌクレオチドを用意する。凍結乾燥した各単鎖DNAを1 µmolずつ、800 µLのオートクレーブ済み二回蒸留水に溶解し、ボルテックスした後、15分間静置する。その後、さらに800 µLを加える。

20〜30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対し、各サンプルに予め加熱した2倍濃度のローディングバッファーを添加し、大サイズの10%変性ゲルを準備します。重合後、コームを取り除き、ウェル内を十分に洗浄します。上下のリザーバーに1倍濃度のTBE電気泳動バッファーを満たし、ゲルの組み立てを完了させます。

ゲルを750 Vでプレランし、ゲルの温度を55 °Cまで上昇させます。その後、電気泳動を停止し、ウェルをランニングバッファーで十分に洗浄します。次に、オリゴヌクレオチドを90 °Cで2分間加熱します。

ボルテックスして遠心分離します。その後、直ちにサンプルをゲルにロードします。オリゴヌクレオチドが移動するまで、約700 Vで電気泳動を行います。

10%ポリアクリルアミドゲルにおいて、alph phenol blueは約20塩基のオリゴヌクレオチドと、xylene syl ffは約60塩基のオリゴヌクレオチドと共に共泳動します。装置からゲルを取り出し、平らな場所でスペーサーを取り除きます。ガラスプレートの一方を外して、ゲルをプラスチックラップで覆います。

次にゲルを裏返し、もう一方のガラスプレートを取り除き、ゲルをラップで覆います。続いて、ゲルの背後にUVライトと蛍光プレートを用いてバンドをマークします。カミソリを用いてDNAのシャドウを確認しながら、目的のバンドを切り出し、細かく刻みます。

各サンプルを滅菌済みの15 milliliterチューブに移します。9 milliliterの溶出バッファーを加え、37 degrees Celsiusで撹拌しながら一晩希釈します。ゲルロード用ピペットチップを用いて、溶液をオートクレーブ可能な遠心チューブに注意深く移します。

アクリルアミドの断片が混入するのを避けるため、pH 7 の 3 mM 酢酸ナトリウム 1 mL と、冷却した 100%エタノール 25 mL を加え、-20 °C で 3 時間以上インキュベートします。沈殿した DNA を遠心分離します。その後、SpeedVac を使用して中温でペレットを乾燥させ、各ペレットをオートクレーブ済みの 2 回蒸留水 400 µL で再懸濁し、新しいチューブに移します。

pH 7の3 M酢酸ナトリウムを40 µLと100%エタノールを1 mL加え、ボルテックスして-20 °Cで30分間インキュベートする。18,000 ×gで15分間遠心分離した後、残留塩を除去するためにDNAペレットを100 µLの70%冷エタノールで洗浄し、18,000 ×gで6分間遠心分離する。その後、エタノールを捨て、スピードバクでペレットを乾燥させる。

次に、各ペレットを100 µLのオートクレーブ滅菌2回蒸留水で再懸濁します。分光光度法によりオリゴヌクレオチドの濃度を決定します。ヘミメチル化DNA二本鎖を調製するには、まず相補的なシングルストランドを等モル濃度で混合します。

その後、水槽を用いて混合物を95 °Cで5分間加熱し、ストランドをアニールさせます。水槽内でサンプルをゆっくりと室温まで冷却してください。81 µMの精製CQaタンパク質と81 µMのヘミメチル化DNAを等量ずつ混合します。

その後、室温で15分間インキュベートします。市販のスパースマトリクススクリーンを用いて結晶化条件を検討するまで、4 °Cで保存します。初期の結晶化リードが特定されたら、回折品質の結晶を成長させるために条件を最適化します。得られたCK DNA結晶をクライオ保護します。

結晶化溶液中のPEG 400の量を最終濃度25%まで増やすか、結晶化溶液に20%グリセロールを添加します。ナイロンループを使用して個々の結晶をすくい上げます。サンプルを液体窒素中で凍結させます。

次に、100 Kで各結晶の回折限界をテストします。Hemi methylated DNAに結合したCKの短縮変異体の結晶構造を得るために、DNAに関する3つのパラメータ、すなわちHemi methylated GATC配列間の間隔、二本鎖の長さ、および5'オーバーハングの有無を順次最適化します。本研究では、C末端ドメインにさらなるリガンド化を防ぐ点変異を導入し、DNA結合をタンデムに制限する短縮リンカーを備えたDMEのseek a変異体を使用しています。

DNA電気泳動移動度シフト検定において、GATCリピートがちょうど1回転分だけ離れた条件で解析した結果、修飾CKタンパク質は9〜10塩基対の間隔で離れたGATCリピートに優先的に結合することが示されました。したがって、初期スクリーニングでは、9または10塩基対の間隔で離れた2つのヘミメチル化GATCリピートを含む、長さ23〜24塩基対の二本鎖DNAを使用します。

3つの二本鎖から、良好な形状の結晶が得られました。いずれの結晶も高分解能での回折は得られませんでしたが、データにより、結晶化には9塩基対のA-G-A-T-C分離が好まれることが示されました。また、2つのGATC部位の間にCGジヌクレオチドを挿入してグルーブのバックボーン相互作用を予期せず強化しても、結晶の回折限界に変化はありませんでした。

対照的に、オーバーハングの長さを最適化することで、分子接触と結晶形態が劇的に変化しました。このCKタンパク質と半分メチル化されたDNA二重鎖の複合体の結晶構造から、タンパク質とDNAの相対的なサイズにかかわらず、DNA二重鎖の自由面は結晶接触に関与していないことが確認されました。対称操作による隣接分子間の相互作用のほとんどは、タンパク質-タンパク質間およびタンパク質-DNA間の相互作用によって媒介されています。興味深いことに、この特定のケースでは、5'末端のジヌクレオチド・オーバーハングによる有益な効果は、擬似的に連続したDNAの形成によるものではありませんでした。

むしろ、メチル化ストランドの5'末端はDNA軸から離れる方向に突き出し、複合体の近接するCK分子と相互作用しています。このことが、結晶パッキングを変更するために2つのヌクレオチドが厳密に必要であった理由を説明しています。このビデオを視聴することで、タンパク質の精製方法およびタンパク質-DNA複合体の結晶化に向けたDNA二本鎖の設計方法について、十分な理解が得られたはずです。本プロトコルはCK-DNA複合体を結晶化させるために考案されたものですが、DNAの長さ、配列、および末端を合理的に最適化することは、他のタンパク質-DNA複合体の結晶化に向けたDNA二本鎖設計の一般的な枠組みとなることを覚えておくことが重要です。