特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

この手順の全体的な目標は、機能マップ内のマイクロドメインを正確にターゲットにして、ニューロンの構造と機能を高解像度で研究することです。これは、最初に皮質の広い領域に対して内因性シグナルイメージングを実行して、目的の刺激特徴のマップを取得することによって達成されます。2番目のステップは、高解像度からフォトンイメージングの対象となるマップ内の正確な位置を決定することです。

次に、蛍光色素を充填したピペットを慎重に配置した後、ニューロンを蛍光マーカーで標識します。最後に、ニューロンの応答または構造の高解像度から光子までの画像が収集されます。最終的には、固有シグナル特徴マップを使用して、方位風車の特異点などの関心領域を見つけ、単一のニューロン分解能での研究のターゲットにすることができます。

このプロトコルの主な利点は、システムを数回すばやく調整するだけで、同じ顕微鏡セットアップを使用して、異なる空間スケールで皮質をイメージングできることです。これにより、これらの技術を組み合わせて、高分解能イメージング用の蛍光プローブで標識するニューロンの領域を選択するためのガイドとして、コース分解能の固有シグナルマップを使用することができます。動物は、施設の動物管理誘発委員会が承認したプロトコルに従って麻酔をかけられ、頭蓋骨が露出して洗浄されました。

デンタルセメントミックスは、中央に長方形の開口部があるステンレス製のヘッドプレートを頭蓋骨に取り付けるために使用されています。ヘッドプレート上部の金属チャンバーは、水浸対物レンズでイメージングするためのリザーバーとして機能します。ヘッドプレートは金属製の支柱を使用してXYステージに固定されています。

デンタルドリルを使用して、ヘッドプレートの長方形の開口部内の骨の広い領域を薄くします。骨のワックスを塗るには、時折の出血を止める必要がありました。薄い領域は、計画された開頭術の境界を超えながら拡張する必要があります。

次に、開頭術のために骨に2×2ミリメートル四方の輪郭をドリルで開けます。新鮮な人工脳脊髄液でチャンバーを定期的にすすぎ、骨片を取り除き、下にある皮質への熱放散を最小限に抑えます。次に、3番の鉗子で骨を持ち上げます。

5番の鉗子とバナスプリングハサミを使用して、硬膜の上層を取り除き、下層はそのままにします。硬膜の最後の層は透明で、剥がれた血管がそれを通してはっきりと見えるはずです。A CSFに溶解した温かい2%エアロスを一滴垂らし、すぐに開頭術の上にカバーガラスを置きます。

まず、カバーガラスの外側にA CSFを染み込ませたゲルフォームを塗布し、固有シグナルイメージング中にアグロスが乾燥するのを防ぎます。次に、2つの写真顕微鏡の上部にある標準Cマウントポートに固有信号イメージングCCGカメラを取り付け、XYステージ位置近くのエアテーブルに照明光源を配置し、ライトガイドを開頭術に固定します。一次ダイクロイックとミラーを海山ポートの下に引っ込めて、固有信号に必要な反射した赤色光が開頭術から直接CCDカメラに通過するようにします。

皮質が加熱するのを防ぐために、光路に赤外線フィルターを挿入します。次に、緑色の光を通すフィルターを配置し、皮質表面血管のデジタル参照画像を記録します。次に、Zフォーカスを皮質表面の500ミクロン下に移動します。

緑色のフィルターを赤色のフィルターに交換して、皮質を照らし、固有の信号を測定します。皮質が均一に照らされていることを確認してください。視覚刺激ディスプレイによって生成される光から開頭術を遮蔽し、視覚刺激のシーケンスを提示し、反射率データ画像を記録して方位マップを生成する10分以内に、4つの方位と各方位に対する2つの方向を持つ8つの刺激のシーケンスの4回の繰り返しに対応するデータを収集する。

次に、固有信号データを解析して、次に示すように偽方位カラーマップを生成します。次に、ニューロンの2光子標識の潜在的な標的領域を選択します。たとえば、向きのピンホイールの特異点は、すべての優先向きが収束するマップ内のポイントです。

次に、方位マップと皮質表面血管系の画像を重ね合わせ、機能ドメインのレイアウトと大きな表面血管の位置を使用して、大きな血管や動脈のある場所を避けてターゲットを選択します。蛍光D溶液を調製し、書面によるプロトコルの指示に従って長いテーパーピペットを引っ張ります。5マイクロリットルの染料混合物をピペットに入れます。

次に、硬膜の最終層を取り外してピペットの挿入を容易にし、この図に示すように最高品質の2光子画像を取得します。ピペットは、チャンバーと対物レンズの間を通過するために、30度の角度で皮質に打ち込む必要があります。したがって、ピペットのエントリー位置の皮質表面位置は、対象とする対象領域の真上にはなりません。

例えば、皮質表面の200ミクロン下にある標的領域を標識するには、皮質表面上のピペットの入口位置は、標的位置から約350ミクロン横になります。XYステージを動かして、皮質表面のエントリー位置を20 xまたは40 xの対物レンズの下の中央に配置します。エントリーポジションが対物レンズの中央に配置されたら、対物レンズのZ位置を2ミリメートル上げます。

次に、緑色のエピ蛍光ライトをオンにし、ピペット内の赤色のAlexa色素を視覚化し、先端が皮質表面の入口位置より上に来るまでピペットを動かします。明視野照明を備えた顕微鏡の接眼レンズを通してピペットの先端を見ながら、先端が皮質表面上の目的のエントリー位置に達するまでピペットを下げます。次に、対物レンズを取り外し、糸くずの出ない吸収槍を使用して、開頭術から余分な脳脊髄液を吸い上げ、隣接する骨を乾燥させます。

次に、皮質を安定させるためにA CSFに溶解した温かい3%ローズを一滴塗布します。arosが固まったら、40倍対物レンズを挿入し、チャンバーにCSFを補充します。次に、マイクロマニピュレーターの対角線軸を使用して、先端が皮質の目的の深さに達するまでピペットを動かします。

DI混合物の時折の圧力放出パフは、ピペットが第2層に達したときにピペットの先端が詰まる可能性を減らし、DI混合物の3つの小さなパフは余分な細胞空間を照らし、直径300〜600ミクロンの皮質の球体にニューロン体をロードするための暗い影として円形の細胞体の密集したアセンブリを明らかにします。Dix混合物を30〜90パルスを使用して細胞外空間に注入します。各パルスは 1 秒、2 PSI から 10 PSI です。

注入が完了したら、数分待ってからピペットと対物レンズを取り外してください。蛍光カルシウムインジケーターは、1時間でニューロンによって完全に取り込まれます。最後に、ダウンロードに使用したアロスを取り外し、録音チャンバーをすすぎます。

表面に2〜3%の小さな滴を置き、開頭術の上にカバーガラスをすばやく置きます。高NA 20 x対物レンズを対物レンズホルダーに挿入し、ラベル付けされた皮質領域を対物レンズの下に再配置します。XYステージを使用して、開頭術を外部の光源から遮蔽し、標識されたニューロンの高解像度画像をin vivoで収集します。

あるいは、シングルセルエレクトロポレーションを使用して、樹状突起の形態や樹状突起の機能イメージングを研究することもできます。この方法論では、DIは書かれたプロトコルに従って準備されます。次に、手順の適切なポイントで、ピペットチップをニューロン細胞体膜に隣接して配置し、軸索を使用して1〜3パルスを印加します。

ニューロンの色素による即時充填は、2光子顕微鏡で容易に視覚化できます。この画像は、視覚野層23で蛍光カルシウムインジケーターOGB 1:00 AMで標識された細胞体を示す2光子画像化された領域を示しており、スケールバーは100ミクロンを表しています。この画像は、前の画像に示したのと同じ部位からの個々のニューロン細胞体の配向選好を示しています。

好ましい刺激方向の整理されたマップは、画像化された領域を中心とする風車の特異点の周囲に見られます。ここでは、固有信号イメージングで得られた方位マップを示します。黒い四角形は、前の 2 つの光子画像に示されている領域に対応しています。

この画像は、1つのニューロンの樹状突起と細胞体を配向マップで重ね合わせたものです。ニューロンは、2光子誘導下でAlexa floor 5 94でエレクトロポレーションされました。Z スタックを in vivo で収集し、樹状突起プロセスをソフトウェアとして Neuro Lucid を使用してオフラインで追跡しました。

配向マップは、シングルセルエレクトロポレーションの前に内因性シグナルイメージングを使用して取得されました。スケールバーは100ミクロンを表します。皮質層1からのこの10ミクロンのZ投影は、頂端樹状突起を示しています。

赤い矢印は樹状突起に沿った棘を示し、皮質層2から3のこれらの10ミクロンのZ突起は、赤い矢印で示された棘と白い矢印で示された軸索を持つ基底樹状突起を示しています。この方法は、さまざまな空間スケールで皮質の機能マップを研究し、特定の関心領域のニューロンを正確に標的にするのに役立ちます。このマップ内では、方位選択マップを調べる方法の適用を実証しましたが、網膜、トッピー、眼球優位、方向などの他の視覚特徴マップ、または体細胞感覚や聴覚をコードするマップなど、機能的に組織化されたマップを持つ他の感覚モダリティに拡張できます。