ナノ析出法を通じて、ジブロック高分子ナノ粒子の製剤

本手順の目的は、ナノ沈殿法を用いて高分子ナノ粒子を合成することです。まず、EDC/NHS反応を行うことでPLGA-PEG共重合体を生成します。次に、このPLGA-PEG共重合体を用いて、ナノ沈殿法により目的の薬物またはカーゴを封入したナノ粒子を生成します。

この段階で、動的光散乱法、透過型電子顕微鏡、またはHPLCを用いて、サイズ、表面電荷、薬物封入効率を含む基本的な生物物理学的特性評価を行うことができます。この技術の意義は腫瘍治療にまで及び、難溶性の抗がん剤を輸送できるため、現在の治療法よりも効果的である可能性があります。この手法は、がん治療に関する知見を提供し得ます。

本手法は、細胞内輸送などの他の系の研究にも利用可能です。ナノ粒子に標的リガンドを結合させ、イメージング剤を用いてin vivoまたはin vitroで可視化することで、本技術を実証できます。本日は、当研究室の技術者であるRohit SukumarとNatalie Cummingsの2名が担当します。PLGA-PEG共重合体の合成を開始するには、カルボキシル化PLGAをアセトニトリルに5 mMの濃度で溶解し、緩やかに撹拌します。

次に、PLGAに対して5倍モル過剰となるよう、NHSとEDCをそれぞれ25 millimolarの濃度になるまで添加します。溶液を約1時間緩やかに撹拌し、PLGAのカルボキシ基をPLGA-NHSに変換させます。1時間後、洗浄液であるメタノールを溶液の約10倍量添加し、反応生成物であるPLGA-NHSを沈殿させます。溶液を2000 ×gで遠心分離してPLGA-NHSをペレット化し、遠心分離後に上清を廃棄してEDCとNHSの痕跡を除去します。このメタノールによる洗浄手順を少なくとも3回繰り返します。

洗浄完了後、PLGANHSを真空下で30分間乾燥させ、洗浄液の残渣を完全に除去します。次に、PLGAの溶解に最初に使用したときと同じ濃度になるように、PLGANHSペレットをアセトニトリルで再溶解させます。

溶解後、ヘテロ二機能性PEGをPLGA溶液に添加します。濃度は5 mMとして添加してください。

混合溶液を、一定の速度で攪拌しながら24時間インキュベートします。過剰量のメタノールを添加し、PLGA-PEGブロック共重合体の反応生成物を沈殿させます。洗浄および遠心分離工程をさらに3回繰り返し、未反応の過剰なPEGをすべて除去します。

合成の最終工程として、PLGA PEGブロック共重合体を真空状態で乾燥させます。ナノ粒子沈殿法は、PLGA PEGブロック共重合体と封入する薬剤をA-P-L-G-A溶媒に溶解させることから始まります。溶媒の選択は、ナノ粒子の特性に影響を与えるため極めて重要です。次に、ポリマーと薬剤の混合液を、攪拌した3〜10倍量の水に滴下し、最終的なポリマー濃度が約3 mg/mLになるようにします。滴下して加えてください。

適切なサイズのナノ粒子を形成させるためには、水相への有機溶液の添加が極めて重要です。減圧下で2時間撹拌を続け、自己組織化によるナノ粒子の形成を促し、有機溶媒の痕跡を除去します。2時間の撹拌後、

アムコンフィルターを用い、2,700 ×gで10分間遠心分離してナノ粒子を濃縮します。次に、PBSでナノ粒子を洗浄して捕捉されなかった薬物を除去し、続いて遠心分離を行います。最後に、ナノ粒子をPBSで再懸濁します。

ナノ粒子の特性をより詳細に把握するために、サイズ、表面電荷、薬物封入効率を含む基本的な生物物理学的特性評価を行うことができます。ナノ粒子は、書面によるプロトコルに記載されている方法で保存することが可能です。PLGA PEGナノ粒子の特性評価にあたり、ナノ粒子のサイズ、分布、および構造を確認するために透過型電子顕微鏡を用いました。粒子サイズは一般的にナノメートル範囲となります。

不均一なサイズ分布を伴う大きな粒子径は、抱合反応のエラーか、あるいはナノ沈殿法の最適化が必要であることを示唆している可能性があります。ここでは、標準的なHPLCを用いてパクリタキセルの封入効率および放出量を定量化した、薬物放出速度論試験を示します。既知の固定量のナノ粒子を、一定の時間間隔で透析しました。

透析ユニット内の内容物を回収し、等量の有機溶媒を加えてナノ粒子を溶解させた。その後、これらのサンプルを用いてHPLC測定を行った。パクリタキセルの含有量を定量した。このナノ沈殿法は、習得すれば3時間で適切に実施することが可能である。

本手法を実施する際は、粒子形成後の粗大粒子の発生を防ぐため、常に有機相を水相にゆっくりと加えるようにしてください。この技術により、ナノメディシン分野のがん研究者は、従来の手順ではがん患者への毒性が強すぎると考えられていた難溶性薬剤の使用を検討することが可能となりました。難溶性薬剤が有効であるか、全身毒性が解消されたか、あるいは標的リガンドがナノ粒子を適切に目的地へと誘導しているかといった疑問を明らかにするために、in vivo 薬効試験やイメージング解析などの他の手法を併用することができます。